健脾補腎活血方對大鼠骨髓源內皮祖細胞生物學功能的影響

尚官紅，王曉麗，劉向哲

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.南陽張仲景醫院，河南 南陽 473000；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是臨床常見的由腦血管病變導致的神經系統性疾病，嚴重威脅人類健康[1-2]。現代醫學認為，血管內皮細胞(Endothelial cells，ECs)損傷是腦血管疾病發生的重要機制之一。內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)主要來源于骨髓，是ECs的前體細胞，可形成ECs并促進血管的形成[3-4]。提高EPCs的增殖及遷移能力，促進腦缺血部位的血管再生,是目前的研究重點。

健脾補腎活血方主要由黃芪、黨參、白術、桑寄生、杜仲、牛膝、丹參、肉蓯蓉、川芎、石菖蒲、甘草組成，具有健脾補腎、活血通絡作用。方中丹參、黃芪能顯著增加EPCs細胞數量，促進內皮修復[5-8]。課題組前期研究結果表明，健脾補腎活血方能改善缺血/再灌注大鼠的神經功能評分，縮小腦梗死的面積，其作用機制可能與增加外周血中EPCs水平有關[9]。本實驗以分離出的大鼠骨髓源內皮祖細胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells，BMEPCs)為研究對象，探討健脾補腎活血方對大鼠BMEPCs增殖、遷移和黏附能力的影響，為健脾補腎活血方的臨床應用提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康清潔級SD雄性大鼠5只，4～5周齡，平均體重(100±10)g，生產許可證號[SCXK(遼)2015-0001]，購自遼寧長生生物科技有限公司。大鼠飼養溫度控制在(22±1)℃、濕度45%～55%、光照節律12 h∶12 h,自由進食飲水。

1.1.2 主要儀器：CO2培養箱(型號HF-90，上海力申公司)、超凈工作臺(型號SW-CJ-2FD，蘇州凈化公司)、酶標儀(型號ELX-800，美國Biotek公司)、倒置相差顯微鏡(型號IX53，日本Olympus公司)、顯微鏡拍照系統(型號DP73，日本Olympus公司)、超速冷凍離心機(型號H-2050R，湖南湘儀公司)。

1.1.3 主要試劑：健脾補腎活血方凍干粉(河南省仲景方藥健康衰老產業工程研究中心實驗室)、大鼠淋巴細胞分離液(批號P8630，北京索萊寶科技有限公司)、乙酰化低密度脂蛋白(Dil labeled acetylated low-density lipoprotein,Dil-Ac-LDL)(批號MP6013，上海懋康生物科技有限公司)、荊豆凝集素-1(FITC-labeled ulex europaeus agglutinin 1,FITC-UEA-1)(批號MP6308，上海懋康生物科技有限公司)、EGM-2MV培養基(批號CC-3202，美國Lonza公司)、胎牛血清(批號SH30084.03，美國Hyclone公司)、胰酶(批號T4799，美國Sigma公司)、MTT(批號WLA021，沈陽萬類生物科技有限公司)、Transwell小室(批號3422，美國Corning公司)、多聚甲醛(批號P6148，美國Sigma公司)、結晶紫(批號0528，美國Amresco公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠骨髓單核細胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)的分離[10]：將5只SD大鼠常規麻醉消毒，無菌條件下取出四肢長骨，無菌PBS沖洗，收集骨髓液。將大鼠淋巴細胞分離液注入離心管中，沿管壁緩慢滴入骨髓液，2000 r/min、室溫、離心20 min，中間的白色云霧層即為單核細胞，無菌PBS清洗2次，以含有10%胎牛血清的EGM-2MV培養基重懸細胞，調整細胞密度至1×106個/ml備用。

1.2.2 大鼠BMEPCs的誘導及培養[11]：取密度為1×106個/ml的細胞懸液，接種到人血漿纖維連接素包被的T25培養瓶中，加入含10%胎牛血清的EGM-2MV培養基，于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養。培養2周左右，原代細胞逐漸融合至80%，調整細胞密度，以1∶2或1∶3進行傳代。

1.2.3 細胞活力檢測：取1滴細胞懸液與1滴0.2 %臺盼藍染液混合，滴在血球計數板上，統計細胞總數并計算細胞活力。細胞活力=活細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 BMEPCs的鑒定：EPCs具有吞噬Dil標記的Dil-Ac-LDL和結合FITC標記的FITC-UEA-Ⅰ的功能。BMEPCs培養14 d后進行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色以鑒定分離出的BMEPCs。調整BMEPCs細胞密度，加入10 μg/ml的Dil-Ac-LDL，37 ℃、5% CO2培養箱中避光孵育4 h，無菌PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗后，加入80 μg/ml的FITC-UEA-1，37 ℃、5% CO2培養箱中避光孵育1 h后，熒光顯微鏡下觀察BMEPCs吞噬Dil-Ac-LDL及結合FITC-UEA-1的情況。

1.2.5 細胞分組及給藥：細胞傳代培養14 d后，取生長狀態良好的BMEPCs，以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，正常培養24 h。細胞饑餓處理后，設空白對照組、健脾補腎活血方低劑量組(0.35g/ml)、健脾補腎活血方中劑量組(0.65 g/ml)、健脾補腎活血方高劑量組(1.0 g/ml)，每組5個復孔。

1.2.6 MTT法檢測BMEPCs增殖：分別予四組細胞給藥繼續培養24 h后加入MTT染色液(20 μl/孔)。孵育4 h后，棄去上清，加入150 μl的DMSO溶解細胞中形成的紫色結晶。避光反應10 min，酶標儀測定波長570 nm處OD值。

1.2.7 Transwell檢測BMEPCs遷移能力：取生長狀態良好的BMEPCs，用無血清的培養基重懸細胞，調整細胞密度至2×104個/50 μl，注入50 μl細胞懸液于Transwell小室上層，將50 ng/ml的VEGF加入到各組含藥培養基中，并注入Transwell下層。在37 ℃、5% CO2環境中繼續培養24 h，計算細胞遷移數。

1.2.8 BMEPCs黏附能力檢測：調整BMEPCs密度至1×104個/孔，鋪在包被人血漿纖維連接素的96孔培養板上，37 ℃培養1 h。用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定后，1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計算梭形細胞數量。

2 結 果

2.1 BMEPCs活力檢測 結果顯示著色細胞數為(4.00±1.00)個，未著色細胞數為(55.67±7.64)個，細胞總數為(59.67±6.66)個，BMEPCs活力為93.3 %，滿足后續實驗要求。

2.2 Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定BMEPCs 熒光顯微鏡觀察結果顯示，BMEPCs攝取Dil-Ac-LDL后，細胞胞漿呈紅色，BMEPCs吞噬FITC-UEA-1后，細胞胞漿呈綠色，同時顯示雙熒光陽性呈橙色的細胞為BMEPCs(圖1)。

A：Dil-Ac-LDL；B：FITC-UEA-1；C：Merge

2.3 各組BMEPCs增殖情況比較 見表1。與空白對照組比較，健脾補腎活血方低、中、高劑量組細胞的吸光度值均升高，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組細胞的吸光度值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。健脾補腎活血方高劑量組細胞的吸光度值高于健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表1 各組BMEPCs增殖情況比較

2.4 各組BMEPCs遷移能力比較 見表2(圖2)。健脾補腎活血方低、中、高劑量組細胞遷移個數均多于空白對照組，且呈劑量依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組細胞遷移個數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。健脾補腎活血方高劑量組細胞的遷移個數高于健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表2 各組BMEPCs遷移能力比較(個)

A：空白對照組；B：健脾補腎活血方低劑量組；C：健脾補腎活血方中劑量組；D：健脾補腎活血方高劑量組

2.5 各組BMEPCs黏附能力比較 見表3(圖3)。健脾補腎活血方低、中、高劑量組細胞黏附數均高于空白對照組，且呈劑量依賴性，差異具有統計學意義(P<0.05)。健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組細胞黏附數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。健脾補腎活血方高劑量組細胞黏附數高于健脾補腎活血方低劑量組、健脾補腎活血方中劑量組，差異具有統計學意義(均P<0.05)。

表3 各組BMEPCs黏附能力比較(個 )

A：空白對照組；B：健脾補腎活血方低劑量組；C：健脾補腎活血方中劑量組；D：健脾補腎活血方高劑量組

3 討 論

研究發現，當腦組織損傷或缺氧時，外周血中EPCs增加，并遷移歸巢至腦組織損傷處，形成ECs以促進血管的生成。由此可見，恢復EPCs的增殖遷移能力，促進血管新生對治療ICVD具有重要臨床意義。EPCs來源于骨髓，具有分化ECs的特點，與中醫 “腎主骨生髓” 理論一致[12]。諸多研究表明，補腎益氣中藥可增加EPCs數量，提高其增殖、遷移及動員能力，從而促進腦缺血區血管修復及再生[13]。補陽還五湯能增加外周血EPCs的增殖、遷移及黏附能力[14]。另有研究發現，補腎活血湯通過激活MMP-9信號通路，使大鼠BMEPCs進入外周血循環，促進其遷移至受損血管內皮處，修復受損血管內皮細胞[15]。趙瑞成等[16]發現，柔肝通絡湯通過增加腦缺血大鼠EPCs的數量，促進大鼠腦缺血后的神經功能恢復。綜上可知，采用中醫藥調控EPCs細胞增殖與分化在中醫理論上具有一定的可行性。

健脾補腎活血方，具有養氣補血、健脾補胃、滋肝補腎的功效[17]。方中黨參、白術取四君子湯意，健脾益氣；桑寄生、杜仲、牛膝、肉蓯蓉補益肝腎，使元氣旺盛，腦髓得充；丹參、川芎活血化瘀，與補氣藥配伍相輔相成；少佐石菖蒲開竅化痰，甘草調和諸藥。現代藥理研究表明，補腎活血方能促進內源性干細胞的增殖和分化，促進內皮細胞的修復[18]。研究發現黃芪提取物可以提高大鼠EPCs的生物活性，促使其發生黏附和遷移，促進血管新生[19]。丹參的水溶性有效成分可通過增加EPCs數量，促進內皮修復[20]。課題組前期臨床研究表明，健脾補腎活血方能夠改善腦梗死患者臨床癥狀和體征，提高患者日常活動能力，臨床效果較好。由此可見，該方在治療缺血性血管疾病方面具有較好的臨床效果，但其是否能增強EPCs細胞的增殖動員能力尚待研究。鑒于此，本研究通過密度梯度法獲取大鼠骨髓單核細胞，并將其誘導生成BMEPCs，體外研究健脾補腎活血方對BMEPCs生物學功能的影響。結果顯示，健脾補腎活血方能顯著提高BMEPCs增殖、遷移及黏附能力，其影響BMEPCs生物學功能的具體作用機制有待進一步研究。