透穴刺法對帕金森病焦慮大鼠杏仁核TNF-α和IL-10表達的影響

馬振旺，梁 浩，趙 兵，蔡紹杰，郭 婧，于 丹

(1.黑龍江省中醫藥科學院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150006；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150000)

帕金森病是常見的神經系統疾病，我國65歲以上人群的患病率約為1700/10萬，至2030年我國帕金森病患者預計將增至494萬，約占全世界帕金森病患者的50%[1-2]。既往認為該疾病主要表現為運動遲緩、肌強直等運動癥狀，近年研究顯示其病理改變可累及周圍神經系統和大腦皮質，從而引起焦慮等多種非運動障礙癥狀[3]。此類非運動障礙癥狀嚴重影響患者生活質量，且常規抗帕金森病藥物難以起效[4]。焦慮是帕金森病非運動障礙的主要表現之一，這可能與神經遞質異常、腦內炎癥反應、杏仁核體積縮小等因素有關[5]。早在《黃帝內經》《中藏經》中已有中醫治療帕金森病相關記載，并將其歸于“顫證”“郁證”“百合病”“臟躁”“不寐”等范疇。針灸的頭穴透刺能夠作用于大腦，改善腦部新陳代謝，促進腦功能重建[6]，有助于帕金森病焦慮的臨床治療，但目前仍欠缺循證學依據。本研究擬通過建立帕金森病動物模型探討透刺療法對帕金森病焦慮的療效，并分析其對大鼠杏仁核腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：自哈爾濱醫科大學實驗動物學部購入健康雄性Wistar大鼠60只，3月齡，體重250～350 g，飼養于黑龍江省中醫藥科學院實驗動物中心動物房(SPF級)，統一喂食由動物實驗中心配制的鼠糧和水，實驗前適應性飼養1周，動物室內相對濕度50%～70%、室溫20～26 ℃、光照黑暗各12 h，自由攝食飲水，避免噪聲、強光等不利條件。

1.1.2 主要試劑與儀器：鹽酸6-羥基多巴(6-Hydrodopamine,6-OHDA)、阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)購自美國Sigma公司；山羊抗兔TNF-α多克隆抗體、大鼠IL-10單克隆抗體購自英國Abeam公司。曠場實驗儀(型號OFT-100，成都泰盟科技有限公司)；高架十字迷宮(深圳瑞沃德公司)；腦立體定位儀(型號SN-2N，日本Narishige公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組與給藥：帕金森病模型制備：大鼠接受水合氯醛腹腔麻醉，頭部固定于腦立體定位儀上，暴露頭骨，依據Paxinos-watson大鼠腦定位圖譜，確定左側內側前腦束位置，腹腔注射地昔帕明溶液5 mg/kg以保護去甲腎上腺素能神經元。30 min后，左側內側前腦束緩慢注射4 μl的6-OHDA，4 min內注射完畢，玻璃微電極在注射部位停留5～10 min，消毒、縫合傷口。所有大鼠術后均注射8萬U青霉素鈉抗感染。手術第14天后，皮下注射0.05 mg/kg的APO 誘發旋轉實驗，如果5 min內大鼠向右側旋轉>20圈，提示帕金森病大鼠造模成功。帕金森病焦慮模型制備：造模成功的大鼠隨機分成正常組、模型組、黛力新組、透穴刺法組各15只。正常組大鼠不接受任何刺激，正常飼養。模型組大鼠單籠飼養，每日隨機接受晝夜顛倒、禁食、禁水、冷水游泳、夾尾、潮濕環境、束縛其中一種刺激造模處理。黛力新組在模型組大鼠干預的基礎上，在每日應激刺激前接受黛力新(國藥準字H20153122)灌胃。黛力新給藥方法：將黛力新溶于純凈水中，按照1.8 mg/kg劑量每日上午9：00～12：00灌胃給藥，1次/d。透穴刺法組在模型組大鼠干預的基礎上，在每日應激刺激前接受透穴刺干預，根據《實驗針灸學》和《中國獸醫針灸學》進行穴位定位，每日上午9：00～12：00采用0.35 mm×25 mm的針灸針自百會穴呈15°向太陽穴方向遞進透刺，行捻轉手法，200 r/min，每次行針2 min，1次/d。每組均連續干預14 d。

1.2.2 行為學檢測：各組大鼠干預結束后第2天上午9：00～12：00進行行為學檢測。①曠場實驗：將大鼠置入曠場，記錄5 min內大鼠在曠場中的穿格數(Number of squares crossed,NSC)和直立次數(Number of rearing,NR)，并記錄在中央區停留時間百分比(Residence time distribution in center，RTDC)。RTDC=(中央區停留時間/總觀察時間)×100%。NSC、NR主要反映大鼠運動能力，RTDC下降則與焦慮行為發生有關。②高架十字迷宮實驗：將大鼠置于中央區，面向任意一個開放臂，記錄其在5 min內進入開放臂和閉合臂的次數及停留時間，計算進入開放臂次數的百分比(Percentage of access the open arms,PAOA)、開放臂停留時間百分比(Residence time distribution in the open arms,RTDOA)。PAOA=開放臂進入次數/(開放臂進入次數+閉合臂進入次數)×100%；RTDOA=開放臂停留時間/(開放臂停留時間+閉合臂停留時間)×100%。PAOA、RTDOA下降與焦慮行為發生有關。每次實驗結束后，噴灑200 ml/L乙醇祛除實驗設備中的殘留氣味。

1.2.3 蛋白免疫印跡(Western blot)實驗：行為學實驗結束后，腹腔注射600 mg/kg水合氯醛深度麻醉，隨后快速心臟灌注150 ml濃度為0.01 mol/L的PBS溶液，予250 ml的40 g/L多聚甲醛固定。斷頭，剝離腦組織并固定4 h，隨后將腦組織轉移至300 g/L蔗糖溶液中，直至腦組織沉底。切取大鼠新鮮杏仁核組織，提取蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，一抗4 ℃過夜，二抗常溫孵育2 h。隨后顯影、定影、拍照，分析IL-10和TNF-α、β-actin各曝光條帶面積和灰度的乘積，計算各指標與β-actin的比值。

2 結 果

2.1 各大鼠NSC、NR、RTDC比較 見表1。各組大鼠NSC、NR比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。模型組RTDC明顯低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；黛力新組、透穴刺法組RTDC高于模型組；且透穴刺法組RTDC高于黛力新組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各大鼠NSC、NR、RTDC比較

2.2 各大鼠PAOA、RTDOA比較 見表2。透穴刺法組PAOA高于正常組、模型組和黛力新組，差異有統計學意義(均P<0.05)。模型組RTDOA低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)，黛力新組、透穴刺法組RTDOA高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，且透穴刺法組RTDOA高于黛力新組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各大鼠PAOA、RTDOA比較(%)

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-10水平比較 見表3(圖1、2)。模型組大鼠TNF-α高于正常組，IL-10低于正常組，差異有統計學意義(均P<0.05)。黛力新組、透穴刺法組TNF-α水平低于模型組，差異有統計學意義(均P<0.05)。透穴刺法組IL-10水平高于模型組、黛力新組，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-10水平比較(pg/ml)

圖1 各組大鼠TNF-α蛋白表達

圖2 各組大鼠IL-10蛋白表達

3 討 論

帕金森病是一種中樞神經系統退行性疾病，焦慮是其常見的非運動系統癥狀之一，采取可靠方案緩解焦慮，有助于改善患者生活質量，提升帕金森病治療效果[7-8]。杏仁核是腦內邊緣系統重要器官，在學習記憶、情緒及行為調控等方面發揮著重要作用，研究顯示帕金森病進展期間杏仁核可能出現神經元形態改變[9]，因此推測其與患者焦慮等癥狀有關，故本研究以杏仁核為研究對象，探討透穴刺法對帕金森病焦慮大鼠杏仁核TNF-α及IL-10水平的影響。

采用6-OHDA損毀單側內側前腦束是帕金森病大鼠的有效造模方案[10-11]，但所制備的帕金森病大鼠模型是否能夠表現出類似于人類的焦慮樣行為，目前仍有一定爭議。劉椰等[12]研究顯示采用上述方案制備的帕金森病模型呈現出一定的焦慮樣行為，但Carvalho等[13]報道指出上述方案制備的帕金森病模型雖然有一定抑郁表現，但欠缺焦慮表現。為規避這一問題，本研究在6-OHDA處理的基礎上，進一步通過每日應激刺激誘導焦慮行為，通過曠場實驗發現，每日應激不會影響帕金森病大鼠的運動能力，但會導致其RTDC下降，高架十字迷宮實驗也顯示每日應激會導致大鼠RTDOA降低，這均說明其表現出焦慮行為，與既往報道[14]結論相符。

本研究結果提示透穴刺法能夠有效改善帕金森病焦慮大鼠的焦慮癥狀，且這種焦慮改善效果優于常見抗焦慮藥物黛力新，這與既往針對焦慮治療的報道結論相一致[15-16]。從中醫理論角度而言，這可能是因為透穴刺法作用于百會穴等百脈匯聚之處，能夠通調陰陽，連貫全身經穴，調節機體陰陽平衡，還可疏肝理氣，平肝潛陽，調暢情志[17]。另一方面，現代神經生理研究也證實，針刺百會穴可以直接興奮上行的激活系統，改善大腦細胞新陳代謝、增強腦活力、提高腦氧含量，從而促進腦功能重建，減輕焦慮樣行為。吳成舉等[18]研究也表明類似的針刺療法能夠促進帕金森病大鼠的腦組織功能恢復。

本研究進一步發現，帕金森病焦慮的形成可能與腦組織炎癥反應有關。腦組織炎癥反應可能損傷神經元，加速細胞外β-淀粉樣蛋白的產生，從而促進帕金森病的發展，并誘發焦慮等非運動系統癥狀，這與張楠等[19]實驗結論相符。本研究中，相較于模型組，透穴刺法組TNF-α表達水平下降，IL-10表達水平升高，說明透穴刺法能夠減輕腦組織炎癥反應，趙鵬等[20]對120例腦卒中患者的隨機對照研究也顯示，針刺療法有助于改善患者全身炎癥反應。