消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及Survivin蛋白表達的影響

鄭 茜，劉遠婷，丁甜甜，李 慧

(新疆醫科大學第七附屬醫院中醫科，新疆 烏魯木齊 830000)

超過70%的肺癌患者確診時已出現轉移，無法接受手術治療，而非手術治療手段不良反應較多，腫瘤晚期患者合并多種基礎病，免疫力低下，無法耐受放化療，因而積極探尋新的有效治療方法是目前研究重點[1-3]。中醫學認為肺癌為本虛標實，正氣虛損、陰陽失調、六淫之邪乘虛而入，引起肺臟功能失衡，宣降失司，氣機不暢，從而血行受阻，津液輸布不暢，津聚為痰，瘀阻脈絡、痰氣瘀毒膠結，發為肺部腫塊。中醫及中西醫結合治療肺癌多傾向于辨證辨病結合，扶正祛邪結合，改善患者癥狀、提高患者生存質量、穩定病灶、延長生存期及提高生存率，而關于中醫作用于肺癌的機制目前研究甚少[4]。Survivin蛋白是以效應細胞蛋白酶受體cDNA在人體的基因組庫雜交篩選中分離而得，參與肺癌的發生發展[5]。本研究擬分析消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長、Survivin蛋白表達的影響，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞株：選取SPF級C57BL/6小鼠60只，雌鼠、雄鼠各30只，4～9周齡，體重19～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。Lewis肺癌細胞株購自中國生命科學院上海細胞庫。

1.1.2 實驗藥物與試劑：消積抑癌外敷方組成如下：當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花、赤芍、甲珠、丹參各30 g，五靈脂、透骨草、青黛、仙鶴草、丹皮、白鮮皮、蛇莓各60 g，莪術、苦參、山慈菇、商陸、延胡索、浙貝母、烏梅、蜂房各120 g，全蝎、蟲、拳參各40 g，蜈蚣40條，冰片9 g。以上中藥材由新疆醫科大學第七附屬醫院中藥房提供，將以上中藥以破壁機研成細粉，將冰片溶入46°白酒制備成冰片酒，調和成膏狀再消毒滅菌裝瓶封制成外敷制劑，濃縮至生藥含量為4.875 g/ml。其他試劑：胎牛血清(武漢博士德公司)，PBS(武漢博士德公司)，二抗PV-6001兔兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒(英國Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(江蘇南京凱基生物有限公司)，免疫組化染色試劑中一抗Survivin(1∶50)兔抗鼠單克隆抗體、鼠抗人單克隆抗體Anti-β-actin、兔抗人單克隆抗體Anti-survivin(美國Santa Cruz公司)。

1.1.3 實驗儀器：恒溫CO2培養箱(Thermo公司)、低溫高速離心機(3K-15型，德國Sigma公司)、顯微鏡(BX60型，日本Olympus)、病理切片機(RM2016型，上海徠卡儀器有限公司)、光譜掃描多功能酶標儀(ELX808IU型，美國Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及建模：60只小鼠以隨機數字表法分為四組，每組各15只，依次為對照組、消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組。建模：選擇生長良好的對數生長期Lewis肺癌細胞，經胰酶消化，濃度調整為1×107個/ml后均經小鼠右側腋部皮下接種0.2 ml。在建模8 d后，可觸及皮下結節、瘤長至100～300 mm提示建模成功[6]。

1.2.2 給藥方法及取材：建模后，對照組0.80 ml/20 g0.9%氯化鈉溶液調和的面糊外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組分別予以0.20 ml/20g、0.40 ml/20g、0.80 ml/20g的消積抑癌外敷方外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。各組均連續干預30 d后以頸椎脫臼法將小鼠處死，同時剝離各組小鼠瘤組織。

1.2.3 HE染色：取瘤旁及瘤體組織，4%中性甲醛固定后的標本經脫水、透明、浸蠟與包埋后，制成蠟塊。以Leica RM2235石蠟切片機進行連續切片，厚度5 μm，切片經脫蠟后予以常規的蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡下觀察組織學形態并拍照記錄。

1.2.4 抑瘤效果評估：取出完整的腫瘤組織后稱重，計算抑瘤率。抑瘤率為對照組與觀察組的平均瘤重差值占對照組平均瘤重百分比。

1.2.5 胸腺指數、脾臟指數：在剝離瘤體后，取小鼠胸腺、脾臟組織，稱重。胸腺指數=10×胸腺重量(g)/鼠重(g)、脾臟指數=10×脾臟重量(g)/鼠重(g)。

1.2.6 肺轉移灶個數：將雙肺完整取出后，應用苦味酸固定，鏡下對雙肺表面轉移灶數進行統計。

1.2.7 免疫組化法測定Survivin蛋白表達水平：經SP免疫組化法對腫瘤組織Survivin蛋白表達水平進行測定。取新鮮腫瘤組織，以10%中性甲醛固定24 h后切塊、脫水、石蠟包埋，以切片機切片，每蠟塊連續切片3張，厚度4～5 μm，切片脫蠟水洗后高壓熱修復，以3%H2O2阻斷過氧化酶，PBS洗滌3 min×3次，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB顯色2 min，蘇木素復染，透明后封片鏡檢。嚴格依據半定量評分系統評定染色效果[7]，著色強度、陽性細胞所占百分比兩項乘積<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)，3～5分為弱陽性(+)，6～9分為中陽性()，>9分為強陽性表達()。

1.2.8 Western blot法測定Survivin蛋白表達：取新鮮腫瘤組織并移入無菌的離心管，1000 r/min、離心5 min，以4 ℃預冷的PBS洗滌2次，將殘余液體吸干后每瓶細胞加300 μl細胞裂解液，冰上搖勻30 min，待細胞充分裂解后收集到不含RNA酶的1.5 ml預冷離心管，取上清應用BCA法定量，采用PVDF膜進行濕轉，5%脫脂奶粉行免疫印跡、封閉、孵育，將殘留的一抗洗掉后加二抗，室溫搖床1 h，洗去膜上殘留二抗，避光滴加配制好的ECL化學發光A、B混合試劑，經數字凝膠成像系統對PVDF膜進行掃描，按照內參條帶測出目的條數，計算相對表達量。相對表達量=目的條帶灰度值/內參灰度值。

2 結 果

2.1 瘤旁及瘤體組織的HE染色結果 HE染色結果(圖1)可見瘤旁組織的肺泡未增厚，腺圈不明顯；瘤體組織見肺泡壁明顯增厚，觀察到肺腺癌的病理特征，腺圈明顯。

2.2 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較 各組小鼠體重兩兩比較，差異無統計學意義 (均P>0.05)。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重均低于對照組，且消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重依次降低，而抑瘤率逐漸增加，三組組間比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較

2.3 各組小鼠胸腺指數、脾臟指數比較 消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組胸腺指數、脾臟指數均高于對照組(P<0.05)。消積抑癌高劑量組胸腺指數高于消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組，差異有統計學意義(均P<0.05)；消積抑癌高劑量組、消積抑癌中劑量組小鼠脾臟指數高于消積抑癌低劑量組，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠胸腺指數、脾臟指數比較(mg/10 g)

2.4 各組小鼠肺轉移灶個數比較 對照組肺轉移灶平均(14.23±1.56)個>消積抑癌低劑量組(10.12±1.35)個>消積抑癌中劑量組(8.49±0.88)個>消積抑癌高劑量組(6.43±0.67)個。消積抑癌不同劑量組間比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.5 各組小鼠Survivin蛋白表達比較 對照組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽性率及Survivin蛋白相對表達量均高于不同劑量的消積抑癌組，差異有統計學意義(P<0.05)。消積抑癌高劑量組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽性率及Survivin蛋白相對表達量最低。見表3(圖2、3)。

表3 各組小鼠Survivin蛋白表達比較

A：對照組；B：消積抑癌低劑量組；C：消積抑癌中劑量組；D：消積抑癌高劑量組

A：對照組；B：消積抑癌低劑量組；

3 討 論

肺癌為臨床常見的惡性腫瘤，肺癌的發病率和病死率逐年攀升[8-9]。手術、放化療為肺癌的主要治療方案，近年來中醫藥治療逐漸受到關注。中醫認為肺癌以肺脾虛為本，痰瘀為標，久病及腎；肺癌證型主要有氣滯、血瘀、痰濕、熱毒等，依據臨床表現可歸于“咳嗽”“痰飲”“息奔” “肺積” “咯血” “肺花瘡” “胸痛”等范疇[10]。蔣艷玲等[11]發現，中藥化痰消瘤方能對Lewis荷瘤小鼠發揮抑瘤作用，并對抗肺癌轉移，且以高劑量組療效最顯著，其作用機制可能是上調腫瘤E-cad表達，導致腫瘤細胞間黏附增加，使其向周圍組織侵襲力減輕，且可顯著下調腫瘤細胞的表達，減輕腫瘤細胞與基質間的黏附，使腫瘤細胞侵襲及轉移受到抑制。Survivin為凋亡基因，其能抑制凋亡，調節細胞分裂，于多種惡性腫瘤中高表達，而正常組織中幾乎不表達[12]。李興培教授提出治療肺癌的臨床方案為以扶正消積湯內服聯合消積抑癌外用方，或單用消積抑癌外用方，與西醫放、化療有機結合，可緩解患者癥狀并穩定病灶，提高放化療效果，使患者帶瘤生存水平提升，增強機體的免疫功能，減輕放化療所致消化系統、血液系統的不良反應。因此本研究建立Lewis肺癌荷瘤模型，分析消積抑癌方外敷治療的抑瘤作用及其作用機制，為后續臨床治療提供理論依據。

本次通過建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，分析本院消積抑癌外敷方對其腫瘤生長的影響，從結果來看Lewis肺癌荷瘤小鼠予以消積抑癌外敷方后可起到抑制腫瘤生長、減少腫瘤轉移的作用。此外本次研究發現，隨消積抑癌外敷方給藥劑量增加，Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重逐漸減少，抑瘤率逐漸增加，說明其治療效果呈劑量依賴性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，這與周婷婷等[13]的研究結論吻合。

本次采用的消積抑癌外敷方由新疆名中醫李興培教授創制，李教授論治腫瘤的辨證思想融合了金元時期張從正和張元素的學術主張。張從正認為：“蓋邪未去而不可言補，補之則適足資寇”“損其有余所以補不足也”。張元素認為：“養正積自除”。故李興培教授取兩家之長，以“攻補兼施”為指導思想，創制了扶正消積湯(內服方)和消積抑癌外用方，內服“補其不足”，外敷“損其有余”。消積抑癌外敷方中多選用蟲類藥以通絡消積、以毒攻毒；選用活血破瘀消積藥以清瘀毒，如當歸、川芎、乳香、沒藥等；選用清熱解毒散結藥物如苦參、山慈菇、商陸等[8]；輔以冰片、白酒的辛散透皮，引藥到達病所；諸藥配伍可發揮清熱解毒、活血消積、以毒攻毒等功效[14-16]?，F代藥理研究表明當歸[17]、川芎[18]可活血、補血，抑制Lewis小鼠移植瘤生長，其作用機制可能是直接作用于癌細胞，發揮抗血管生成作用；紅花中紅花黃色素可較好緩解及保護呼吸系統相關疾病[19]；莪術[20]、赤芍[21]、丹參[22]能較好抑制腫瘤組織轉移、血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，并能調節機體免疫功能、抑制肺間質纖維化。

研究結果發現消積抑癌外敷方高劑量組的胸腺指數、脾臟指數較消積抑癌外敷方低劑量組、消積抑癌外敷方中劑量組高，消積抑癌外敷方中劑量組脾臟指數高于消積抑癌外敷方低劑量組，這與謝英瑛[16]的報道結果相似，說明消積抑癌外敷方可提高Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官指數，保護小鼠免疫功能，增強腫瘤的免疫應答水平，且呈劑量依賴性，這可能和中藥活性成分發揮藥理作用有關系，其具體機制可在后期研究中進一步探討。

Survivin為最強的凋亡抑制因子，也是唯一和細胞周期有密切關系的IAP家族成員，通過BIR重要序列抑制Caspase依賴的細胞凋亡途徑；Survivin也可促進p21與線粒體中Caspase-3結合，而明顯抑制Caspase活性，促進細胞分裂，抑制細胞凋亡[23-24]。本研究中對照組Survivin蛋白積分、陽性率與相對表達量均高于消積抑癌外敷方各劑量組，其中消積抑癌外敷方高劑量組的Survivin蛋白積分、陽性率與相對表達量最少，表明消積抑癌外敷方可抑制Lewis小鼠Survivin蛋白表達。李巧玲[25]發現，愛康方(組方：生薏苡仁、通關藤、金蕎麥、桃仁、紫珠葉、臭殼蟲、花蕊石、三七、血余炭)對人肺腺癌A549、小鼠Lewis細胞內的Survivin蛋白及基因表達有一定影響。此外也有研究發現Survivin是細胞周期調節基因，其表達和肺癌的癌細胞周期密切相關，半衰期僅30 min，于細胞周期G2M期有一定表達，而隨后G1期的mRNA及蛋白表達水平快速下降，Survivin在腫瘤細胞中表達水平升高，抑制癌細胞凋亡，促進癌細胞侵襲周圍組織，導致轉移[26]。但本次未對Lewis荷瘤小鼠的細胞周期進行研究，關于Survivin蛋白對Lewis肺癌荷瘤小鼠的細胞周期調控作用值得進一步探究。

綜上所述，消積抑癌外敷方能較好地抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及Survivin蛋白表達，且呈劑量依賴性。