山慈菇-王不留行干預肺癌向骨轉移過程生物信息學作用機制

劉文佳,劉宗凱,初曉蘇,劉寨東

(1.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250035；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250035)

肺癌是臨床發病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的身心健康，并給患者家庭及社會造成沉重的經濟負擔[1]。2014年的一項流行病學調查顯示，我國新發肺癌病例78.1萬，且同期病死率達80%[2]。肺癌患者初期往往沒有特異性臨床癥狀，57%的肺癌患者就診時已經發生遠處轉移[3]。肺癌遠處轉移最常見的靶組織是骨骼，常引起病理性骨破壞、骨折、疼痛等[4]。因此，探究肺癌骨轉移過程中存在的作用機制具有重要意義。

從近年研究報道來看，中藥在治療腫瘤方面的效果較好，多項研究證實中藥能夠有效影響腫瘤細胞的生長增殖、凋亡、侵襲及遷移[5]。中藥山慈菇具有清熱解毒、化痰散結功效，現代藥理學證明山慈菇具有多種生物堿，有較強的抗癌活性[6]。有研究在統計1374次惡性腫瘤病案中發現，使用頻次最高的是山慈菇，其使用頻率為77.29 %[7]。王不留行具有活血消腫功效，與山慈菇同用表現出對多種腫瘤的抑制作用[8]。

中藥往往是多靶點、多途徑協同作用而發揮療效，因此其機理較難詮釋，網絡藥理學的整體性、系統性、動態性與中醫整體觀念吻合，因此近年有不少學者利用網絡藥理學的方法對中醫藥進行研究。本次通過網絡藥理學相關技術方法探討山慈菇-王不留行這一藥對在肺癌骨轉移過程中的分子作用機制，以期為本病的治療提供新的思路與方法。

1 資料與方法

1.1 疾病靶基因預測 以“肺癌”“骨轉移瘤”作為關鍵詞，采用疾病基因數據庫(Database of gene-disease associations，Dis Ge NET)、人類基因數據庫(Human gene database，Gene Cards)，人類孟德爾遺傳綜合數據庫(Online mendelian inheritance in man，OMIM)，綜合型藥物數據庫(Drug bank online，Drug Bank)以及治療靶標數據庫(Therapeutic target database，TTD)對疾病已知靶基因進行檢索與篩選，合并各數據庫的疾病靶基因，獲得已明確的疾病靶點。

1.2 山慈菇-王不留行有效成分篩選及靶點預測 通過中藥系統藥理學技術平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP)以山慈菇、王不留行為關鍵詞檢索其化學成分，并以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件，將具有較高活性的化合物篩選出來，將所得到的活性成分通過有機小分子生物活性數據庫(Pub Chem)獲得相對應的SMILES及2D結構。將所得結構導入Swiss Target Prediction及Drug Bank數據庫對靶點進行預測，相似性閾值取為0.85，并把人類基因型作為篩查條件。導入蛋白質數據庫(Unitprot)進行基因的標準化處理。利用Cytoscape 3.7.2軟件，構建中藥-有效成分-靶點網絡圖。

1.3 山慈菇-王不留行干預肺癌骨轉移相關鍵靶基因篩選 將所篩選的山慈菇-王不留行潛在靶基因與肺癌及骨轉移瘤靶基因交叉映射，得出山慈菇-王不留行干預肺癌骨轉移過程中的映射靶基因，借助String構建出關鍵靶點PPI網絡信息，根據節點連接度(Degree)值的大小進行篩選，得到核心靶基因，所獲取的核心靶基因則是直接或間接調控肺癌骨轉移過程的關鍵靶點，也就是山慈菇-王不留行干預肺癌骨轉移過程的分子作用機制。

1.4 生物通路及富集分析 將篩選出的核心靶點導入基因功能注釋數據庫(Database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID)，進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本體(Gene ontology，GO)生物過程的富集分析。以P≤0.05為篩選標準，分別將篩選出的前20個GO條目與KEGG條目借助Omic Share云平臺繪制富集分析氣泡圖。

2 結 果

2.1 疾病靶基因預測 以“lung cancer”“metastatic tumor of bone”作為關鍵詞，通過Dis Ge NET、Gene Cards、OMIM、Drug Bank以及TTD數據庫對疾病已知靶基因進行檢索與篩選，整合后共獲得肺癌相關靶基因1097個，骨轉移瘤相關靶基因569個。

2.2 山慈菇-王不留行有效成分篩選及靶點預測 以OB≥30%、DL≥0.18為篩選標準，在TCMSP數據庫共檢索到山慈菇-王不留行活性成分6個，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有較高自由度，見表1。根據SMILES及2D結構預測出作用靶點116個，利用Cytoscape 3.7.2軟件，構建其中藥-有效成分-靶點網絡圖(圖1)。

表1 山慈菇-王不留行活性成分

圖1 中藥-有效成分-靶點網絡圖

2.3 山慈菇-王不留行干預肺癌骨轉移關鍵靶基因篩選 將所篩選的山慈菇-王不留行潛在116個靶基因與獲取的疾病靶基因交叉映射，發現山慈菇-王不留行對肺癌骨轉移的靶基因映射率為2.8%、映射出關鍵靶點35個，作為山慈菇-王不留行干預肺癌骨轉移的直接或間接作用靶標基因，占據該藥對作用靶點的30.2%左右。將這35個關鍵點導入String數據庫，構建映射靶點PPI網絡信息見表2，35個節點在0.4中置信度下有347條相互作用關系。根據Degree≥20進行篩選，得到核心靶點15個，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建核心靶點圖(圖2)。

圖2 核心靶點圖

表2 山慈菇-王不留行對肺癌骨轉移映射的關鍵靶點

2.4 生物通路及富集分析 對“2.3”獲得的15個核心靶點采用DAVID數據庫進行GO生物過程和KEGG信號通路分析，得到生物過程147條、信號通路66條；以P≤0.05、錯誤發現率(false discovery rate，FDR)≤0.05為標準，取前20條以氣泡圖的形式展現出來(圖3、4)。生物通路下靶基因見表3。

圖3 前20條通路的GO生物過程氣泡圖

圖4 前20條通路的KEGG分析氣泡圖

表3 生物通路下的靶基因

3 討 論

中醫學將腫瘤歸為“癥瘕”“乳巖”等范疇，其病機多為氣滯、痰凝、血瘀[9]。劉偉勝教授提出“正虛邪實，癌毒為患”的觀點，認為正氣虧虛是肺癌發生的基礎，而癌毒是致病的直接因素[10]。肺癌病程較長，常導致患者正氣虧損、元氣衰敗、傷津成毒、四散流溢。肺癌晚期患者多因腎氣衰微，無以生髓養骨、骨失所養，則邪毒流竄于骨發生轉移。癌毒瘀滯于骨，則痰瘀搏結、積聚成毒瘤，形成骨質破壞，而疼痛則是痰瘀阻滯所致。中醫藥在肺癌骨轉移的治療中，具有延長患者生存期、改善生存質量等優勢[11]。

經本次網絡藥理學研究發現，山慈菇-王不留行中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有較高自由度，這可能是抑制肺癌骨轉移的重要因素。有研究發現槲皮素能通過抑制Snail介導的上皮-間充質轉化來抑制原位A549異種移植模型中非小細胞肺癌細胞系的遷移/侵襲和骨轉移，并延長存活時間[12]。有研究表明β-谷甾醇能夠抑制肺癌A549細胞的生長,通過調控其細胞周期引起細胞凋亡[13]。β-谷甾醇、豆甾醇均是植物甾醇的重要組成部分，植物固醇通過多種作用機制(包括抑制致癌物的產生、癌細胞的生長、血管生成、侵襲和轉移、促進癌細胞的凋亡等)發揮抗癌作用[14]。另外，MnSOD能夠誘導FoxM1表達并促進肺癌的侵襲遷移性，研究表明異牡荊黃素能夠下調MnSOD、FoxM1的表達，抑制肺癌細胞的這種遷移能力[15]。對217例肺癌患者測序發現，TP53調節的基因與細胞遷移有關，推測是肺癌轉移的關鍵驅動基因[16]。另有研究表明TP53可以促進肺癌細胞分泌A1AT，進一步誘導上皮細胞間質化，以驅動肺癌細胞侵襲和轉移[17]。此外，P53通過上調CXCL5表達增強細胞遷移能力，選擇性除去P53后則該能力下降[18]。同時TP54對骨骼具有較強親和力，能夠誘導成骨細胞成熟而發生骨轉移[19]。相關肺癌細胞研究表明EGFR可以抑制OPG、上調RANKL刺激破骨細胞發生溶骨性骨轉移，而抑制EGFR時這種骨吸收能力減弱[20]。此外，還有研究表明EGFR能夠誘導VEGFA促進腫瘤血管生成，誘導肺癌骨轉移過程[21]。VEGFA通過調控血管生成與通透性，增加肺癌侵襲轉移作用，miR-1被認為是重要抑癌基因，研究表明miR-1可以下調VEGFA活性,抑制肺癌干細胞的轉移和侵襲[22]。當C-jun被激活時會上調其蛋白表達,C-jun蛋白磷酸化能誘導腫瘤細胞的轉化[23]。C-jun蛋白在多種腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的形成和進展,還可促進肺癌的侵襲和轉移[24]。MAPK廣泛存在于細胞中參與細胞內外信息傳導,調控細胞有絲分裂及炎癥反應等，MAPK1是其下游靶標，調節機體的免疫反應[25]。此外，MAPK1也高表達于各種腫瘤中，研究表明通過下調MAPK1可以減弱非小細胞肺癌的細胞增殖、侵襲、遷移能力，并抑制上皮間質轉化[26]。

TNF-α作為一種重要促炎因子，其表達增加能夠促進破骨細胞形成。TNF-α一方面誘導破骨前體細胞分化為破骨細胞，另一方面通過調控相關因子促進破骨細胞活化。當肺癌細胞播散至骨微環境時會與骨襯細胞結合進入休眠期，而破骨細胞能夠去除骨襯細胞重新激活腫瘤細胞，形成轉移灶。此外OPG作為非典型的TNF受體之一,同樣在肺癌骨轉移中具有重要作用，OPG/RANKL/RANK軸在惡性腫瘤骨轉移研究中具有重要地位。類風濕性關節炎是一種慢性免疫性疾病，有數據表明其合并肺癌的概率較高[27]，原因在于其相關免疫抑制治療會引起TNF等促炎因子的表達，增加肺癌發生風險。有關實驗通過小鼠模型證明了免疫抑制劑能夠減弱NK細胞的增殖能力，促進癌癥轉移[28]。蛋白聚糖分布于細胞內外及細胞膜表面，具有多種生物功能，部分蛋白聚糖硫酸化程度降低可導致腫瘤細胞間粘連降低。多配體蛋白聚糖是其中一種，通過細胞內外信息交換誘導細胞生長、分化、黏附及遷移，而腫瘤細胞內合成的多配體蛋白聚糖2在腫瘤血管生成及侵襲遷移方面具有重要作用[29-30]。NOD樣受體通路在免疫功能調節中的作用，已有研究證明其參與肺部的炎癥損傷[31]，其中晚期高表達的NOD1、NOD2能夠影響體內炎癥水平，產生大量炎癥因子，誘導腫瘤生長、侵襲及轉移。此外NOD1還可以激活下游MAPK及NF-κB信號通路,調控體內炎癥免疫反應、氧化應激、細胞增殖等過程，進一步誘導炎癥因子調節破骨細胞干預腫瘤細胞增殖、轉移。所以，山慈菇-王不留行可能通過TNF通路、類風濕性關節炎通路、癌癥中蛋白聚糖通路、NOD樣受體通路調節體內微環境水平調控肺癌骨轉移進程。

肺癌骨轉移是一個復雜過程，腫瘤細胞脫落隨血液循環定植于骨組織并進入休眠，破骨細胞等通過相互作用重新激活腫瘤細胞，進而增殖轉移。經網絡藥理學分析發現山慈菇-王不留行通過活性成分-靶點-通路作用于不同方面調控這一過程，一方面通過抑制體內血管生成構建及炎癥因子的釋放，改善體內氧化應激水平，抑制腫瘤的生長發育；另一方面干預破骨細胞等骨骼微環境下調對轉移腫瘤細胞的激活能力，使其保持休眠狀態。當然腫瘤細胞激活也與自身條件有關，需進一步實驗研究探索。