貴州狐臭柴不同部位提取物及其抗氧化活性

楊寧線 陽 嬌 王艷秋 張明生

(1. 貴陽護理職業學院藥學系，貴州 貴陽 550081; 2. 貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

過量自由基的產生是人體疾病發生的重要原因，抗氧化性物質可通過抑制氧自由基反應的發生來保護生物大分子如脂質、蛋白質及DNA[1-2]等，從而防止許多疾病的發生。雖然有許多人工合成的抗氧化物質，但因安全性和潛在的毒性等不足，合成的抗氧化劑使用范圍受到了較多限制[3]。因此，近年來從植物中尋找安全性更高的天然抗氧化物質，引起了許多研究者的關注[4-5]。研究[6-8]表明，一些藥用植物中的多酚、黃酮等化合物具有顯著的抗菌、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒等生物活性。

狐臭柴(PremnapuberulaPamb.)系馬鞭草科豆腐柴屬植物，其葉片含蛋白質、果膠、過氧化物酶等多種營養成分，可用于食品、化工、醫藥等行業[9-11]。目前關于該植物的研究多集中在植株的生長發育，神仙豆腐的制作及營養保健功能，果膠提取工藝的優化及不同干燥方式對結構的影響等方面[12-15]。僅有李永琴[16]報道過狐臭柴的總酚和總黃酮含量，然而對黃酮類成分的種類、各成分含量及抗氧化活性等的研究尚未見報道。文章擬研究貴州地區狐臭柴總酚和總黃酮成分、含量及抗氧化活性，分析各成分與抗氧化能力的相關性，以期為食品天然抗氧化劑的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

狐臭柴：貴州大學農旅研學實驗示范基地；

柚皮素、芹菜素、蘆丁、槲皮素標品：北京索萊寶科技有限公司；

沒食子酸、維生素C標品：上海源葉生物科技有限公司；

DPPH、ABTS：分析醇，生工生物工程股份有限公司；

甲醇、磷酸等：色譜純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司；

酶標儀：SpectraMax Versamax型，美國美谷分子儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-6000SE型，上海元析儀器有限公司；

超聲波細胞破碎儀：1030HT型，南京舜瑪儀器設備有限公司；

電熱鼓風干燥箱：101-3A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

冷凍離心機：H4-20KR型，湖南可成儀器設備有限公司；

粉碎機：JY-100型，浙江省永康市象珠松青五金廠；

分析天平：BSM-220.4型，上海電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 樣品采集于2020年7月28日，隨機選取5株植物，選取生長狀況良好的根(主根)、莖(主枝條的莖段)、葉(頂端向下第3枝的前3對葉片)3個部位，清洗后分別于50 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，密封，4 ℃貯藏備用。

1.2.2 總酚提取

(1) 提取工藝：參照文獻[16]并修改。料液比(m樣品∶V提取劑)1∶25 (g/mL)、超聲時間60 min、提取溫度60 ℃，4 200 r/min離心10 min，上清液定容至50 mL，測定720 nm處吸光度。

(2) 總酚含量測定：參照文獻[17]，標準曲線方程為y=0.009 1x+0.003 2，R2=0.999 1。

1.2.3 總黃酮的提取

(1) 提取工藝：參照文獻[18]。

(2) 總黃酮含量測定：參照文獻[19]，標準曲線方程為y=0.011 9x-0.001 3，R2=0.999 0。

1.2.4 黃酮類化學成分及含量測定

(1) 對照品溶液的制備：參照文獻[19]并修改。用甲醇溶液配制質量濃度分別為1 080 μg/mL的蘆丁、1 120 μg/mL的柚皮素、1 550 μg/mL的槲皮素、1 030 μg/mL的芹菜素標準品溶液，等比稀釋為梯度質量濃度的對照品溶液。

(2) 供試品溶液的制備：參照文獻[17]，充分搖勻后微孔濾膜過濾。

(3) 色譜條件：參照文獻[9]并修改。色譜柱為capcell pak C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇溶液為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B進行梯度洗脫：0～23 min，50% A；23～28 min，100% A；28～50 min，100% A；體積流量0.9 mL/min，槲皮素檢測波長為256，372 nm，蘆丁檢測波長為256，356 nm，芹菜素檢測波長為268，340 nm，柚皮素檢測波長為290 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

(4) 標準曲線：參照文獻[16]并修改。芹菜素的線性方程為y=89.041x-4.762，r=0.999 0，蘆丁的線性方程為y=15.236x+39.302，r=0.999 1，未檢測出柚皮素和槲皮素兩種黃酮類成分。

1.2.5 抗氧化試驗

(1) DPPH自由基清除能力：參照文獻[20]。

(2) ABTS+自由基清除能力：參照文獻[21]。

1.2.6 數據分析 所有試驗重復3次，結果用平均數±標準差表示，采用Origin 2018軟件作圖，SPSS 23.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 含量分析

2.1.1 總酚及總黃酮含量 由表1可知，狐臭柴根、莖、葉中總酚及總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其中葉片總酚含量最高為30.05 mg/g，約為莖、根中的3倍和9倍；總黃酮和總酚含量的變化趨勢相同，依次為葉>莖>根，其中葉中總黃酮含量為(6.54±0.17) mg/g，約為莖中的10倍，這是因為黃酮類是植物的次生代謝產物，常作為主要成分在高等植物的根、莖、葉普遍存在[22]。這與李永琴等[18]的報道基本一致，說明狐臭柴總酚和總黃酮含量較高，且葉中的總酚和總黃酮含量顯著高于莖的。

表1 狐臭柴不同部位總酚及總黃酮含量?

2.1.2 黃酮類成分 狐臭柴根、莖、葉不同部位中黃酮成分的高效液相色譜圖見圖1，各成分含量見表2。由表2可知，狐臭柴中蘆丁和芹菜素含量分布依次為莖>根>葉，根、莖、葉中蘆丁質量分數分別為(25.68±0.21)%、(74.42±0.32)%，(2.28±0.03)%，芹菜素質量分數分別為(0.24±0.02)%，(0.35±0.02)%，(0.14±0.01)%，各組織器官間均有顯著性差異(P<0.05)，可能與植物根、莖中次生代謝產物豐富有關[22]，但是未檢測出槲皮素和柚皮素，可能是這兩種成分含量太低引起的，與范超敏等[23]的研究結果一致。

圖1 狐臭柴根、莖、葉黃酮成分的高效液相圖譜

表2 狐臭柴不同部位黃酮類化學成分含量?

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 OH自由基清除能力 由圖2可知，狐臭柴中總黃酮的抗氧化能力依次為葉>莖>根，當樣品質量濃度為0.1 mg/mL時，狐臭柴葉的DPPH自由基清除率為82.5%。這是因為DPPH自由基在517 nm處有比較穩定的特征吸收峰，常用于評價抗氧化成分的自由基清除能力[24]。

圖2 狐臭柴不同部位對DPPH自由基的清除率

總黃酮的IC50值與抗氧化活性呈反比，IC50值越小，樣品的抗氧化能力越強[25]。由圖3可知，維生素C與根、莖、葉的IC50值相比具有顯著性差異，狐臭柴根、莖、葉的IC50值分別為(23.38±0.14)，(8.21±0.09)，(1.13±0.06) mg/mL，維生素C的IC50為(0.16±0.04) mg/mL，是因為抗氧化活性與黃酮類成分有較大關系，而狐臭柴具有強的抗氧化活性。謝娟平等[26]研究發現豆腐柴葉的抗氧化能力約為商陸葉的16倍，且同種植物的葉比根的抗氧化性能力強。綜上，狐臭柴葉的抗氧化能力最強，且其半數清除率高于大蒜乙酸乙酯萃取物的[27]。

圖3 狐臭柴不同部位與陽性對照維生素C的IC50值

2.2.2 清除ABTS+自由基能力 由圖4可知，狐臭柴對ABTS+自由基的清除能力為葉>莖>根。黃酮類成分結構中存在多個酚羥基，能提供大量電子，可以將多種自由基轉化為穩定的結構并進一步中斷反應，從而起到抗氧化作用[4]。因此，狐臭柴葉的抗氧化活性最強，且該部位總酚及總黃酮的含量最高，推測狐臭柴的抗氧化活性可能與總酚及總黃酮的含量有關。

圖4 狐臭柴不同部位對ABTS+自由基的清除作用

2.3 主成分分析

運用SPSS 23.0軟件以總酚、總黃酮、蘆丁、芹菜素含量、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力6個指標為變量，對狐臭柴不同組織進行主成分分析，結果見表 3。由表3可知，主成分1個的特征值>1，且其方差貢獻率為86.46%，基本涵蓋了6個指標的86%以上的數據信息。

表3 各成分的特征值、方差及累計貢獻率

由表4可知，第1主成分為總黃酮含量，ABTS+自由基清除能力與總酚含量有較大的得分系數，這與抗氧化活性結果一致，因此可以將總黃酮含量、ABTS+自由基清除能力和總酚含量作為評價狐臭柴根、莖、葉抗氧化活性評價的主要指標。

表4 第1主成分因子得分系數

3 結論

試驗表明，藥食兼用植物狐臭柴根、莖、葉總酚含量分別為3.26，9.58，30.05 mg/g，總黃酮含量分別為0.22，0.58，6.54 mg/g，蘆丁和芹菜素含量依次為莖>根>葉。各組織的抗氧化活性均隨樣品質量濃度的升高而增強，且與總酚、總黃酮含量呈正相關，其中葉的抗氧化活性最強，且葉片產量大，加工方便。綜上，狐臭柴具有良好的抗氧化活性。試驗僅對該植物根、莖、葉的總酚和總黃酮的抗氧化活性進行了初步探究，尚未比較各成分與抗氧化能力之間的相關性，后續應重點關注其他黃酮類成分及含量，并測定黃酮類成分的體內抗氧化活性，為狐臭柴天然抗氧化劑的開發提供更充分的理論依據。