橙汁飲料中橙與橘成分雙重實時熒光定量PCR檢測技術

陳茵茵 李 娟 周 露 陳丹霞 韓志杰 丁清龍

(1. 廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510000；2. 廣東食品藥品職業技術學院，廣東 廣州 510000)

隨著人們生活水平的提高，果汁的需求量和消費量逐年增加，果汁摻假事件也頻繁發生。據統計[1]，世界上約有60%～80%的果汁飲料存在不同程度的摻假現象。消費者很難通過外觀、口感識別這些虛假標識、高價果汁摻雜低價果汁等的摻假果汁飲料。橙汁是國際上消費最廣的果汁之一，其銷量占全球果汁銷量的50%以上[2]。但由于市面上橙類的價格要普遍高于橘類，存在部分不法商販向橙汁中摻雜橘汁的行為。

目前中國對橙汁的鑒別標準有NY/T 290—1995 《綠色食品橙汁和濃縮橙汁》、GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》、GB/T 21731—2008 《橙汁及橙汁飲料》、GB/T 21730—2008《濃縮橙汁》，但均是通過感官和一些常規的理化指標來鑒別橙汁。為此，國內外學者研究了多種橙汁品質鑒別的方法，如：① 理化鑒別(測定糖[3-4]、有機酸[5]、氨基酸[6]等)；② 特定有機物鑒別(測定果膠、黃酮類物質[7]等)；③ 無機物鑒別(測定穩定同位素[8-9]等)；④ 利用先進的設備測定特定成分鑒別(如液相色譜[10-11]、電感耦合等離子體質譜[12]、電子舌[13]等)。但由于水果成分易受品種、產地、季節、環境等因素的影響，以及果汁中摻雜的其他化學成分，給化學成分鑒定造成了困難[14]。

隨著分子生物技術的發展，常規PCR、實時熒光PCR、DNA條形碼等分子生物學方法已經被應用到果汁真偽鑒別中，如：Ng等[15]利用分子生物學方法鑒定鮮榨和還原橙汁；梁宇斌等[16]建立了果汁中柑橘屬植物成分的SYB Green實時熒光PCR檢測方法；劉偉紅等[17]建立了柑橘屬植物成分的普通PCR檢測方法等。以上學者的研究均基于單一水果品種的靶向檢測，未能區分柑橘屬植物成分中的橙和橘成分，在果汁鑒偽中未能鑒別是否是高價果汁摻雜低價果汁。

試驗擬設計并篩選橙、橘成分檢測引物、探針，并建立雙重實時熒光定量PCR的方法檢測橙汁飲料中的橙與橘成分，以期實現橙汁飲料中橙和橘成分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

美國新奇士、印度倫晚臍橙、埃及橙、南非夏橙、廣西砂糖橘、云南丑柑、柑橘、沃柑、黑加侖、紅樹莓、黃樹莓、黃桃、藍莓、葡萄鮮果及橙汁飲料(如表1所示)：京東超市。

表1 橙汁飲料信息

1.1.2 主要試劑

深加工食品DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；

異丙醇：分析純，東莞市嘉誠化工有限公司；

無水乙醇：分析純，佛山月月紅化工有限公司；

2×Super Real Pre Mix (Probe)：北京天根生化科技有限公司；

液氮：廣州盛盈化工有限公司。

1.2 儀器與設備

生物安全柜：1379型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

渦旋混勻器：MS型，德國IKA公司；

臺式離心機：Centrifuge 5430型，德國艾本德股份公司；

冷凍離心機：Stratos型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

恒溫孵育裝置：IKA F2.0型，德國IKA公司；

微量核酸蛋白測定儀：Nano型，日本島津公司；

超低溫冰箱：BioPlus RF 930型，丹麥GRAM公司；

實時熒光PCR儀：QuantStudio 6 Flex型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR擴增產物合成 實時熒光定量PCR擴增引物和探針如表2所示，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物和探針

1.3.2 DNA提取

(1) 水果樣品前處理：取適量水果放入潔凈的預先預冷的研缽中，加入適量的液氮進行研磨，反復重復此步驟至樣品被研磨成粉末狀態，迅速將樣品移至預冷離心管中。不同水果之間的前處理要避免交叉污染，處理后的樣品存放于超低溫冰箱中備用。

(2) 果汁飲料前處理：取適量混勻后的果汁飲料于50 mL離心管中，4 ℃冷凍離心15 min(9 000～10 000 r/min)，棄上清，留沉淀或底部濁汁備用。

(3) DNA提?。簝灮噭┖蟹?。① 取經過前處理后的水果樣品約500～700 mg、果汁飲料約1 mL于離心管中，加入異丙醇1 mL，混勻后在室溫放置10 min，隨后放入離心機于12 000 r/min離心10 min，棄上清，重復此步驟1次；② 加入500 μL緩沖液 GMO1和20 μL Proteinase K(20 mg/μL)，旋渦振蕩1 min，混合均勻；③ 在56 ℃恒溫條件下孵育3 h，孵育過程每隔15 min振蕩混合；④ 加入200 μL緩沖液GMO2，充分混勻，渦旋振蕩1 min后，室溫靜置約10 min；⑤ 12 000 r/min離心5 min，并將上清液轉移至潔凈無菌離心管中；⑥ 向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，混合均勻，置于-20 ℃冰箱內靜止30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，保存沉淀；⑦ 向沉淀物加入700 μL 70%乙醇，混合均勻，靜止10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復此步驟1次；⑧ 打開離心管管蓋，在室溫條件下放置5～10 min，直至徹底晾干離心管中殘余的乙醇；⑨ 加入50～100 μL的洗脫緩沖液TE，旋渦振蕩1 min，最終得到DNA溶液。

1.3.3 DNA提取效果驗證

(1) 純度驗證：利用Nano核酸蛋白分析儀對提取的各個基因組DNA純度(OD260 nm/OD280 nm)以及各自的濃度進行測定，識別DNA提取過程是否受到污染。

(2) 可擴增性驗證：參照SN/T 1204—2016《植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法》對所提取的DNA樣品進行檢測，以確定所提取DNA樣品的可擴增性。所使用的引物和探針見表3，反應體系見表4，反應程序見表5。

表3 植物通用引物和探針

表4 PCR 擴增反應體系

表5 PCR 擴增反應程序

1.3.4 R22引物、探針通用性和特異性驗證 使用美國新奇士、印度倫晚臍橙、埃及橙、南非夏橙、廣西砂糖橘、云南丑柑、柑橘、沃柑8種柑橘屬植物作為驗證樣品，無菌超純水為空白對照，驗證R22引物和探針對擴增柑橘屬植物的通用性。使用黑加侖、紅樹莓、黃樹莓、黃桃、葡萄、藍莓6種常見的非柑橘屬水果作為驗證樣品，砂糖橘和新奇士作為陽性對照，無菌超純水作為空白對照，以確定引物和探針的特異性。反應體系見表6，反應程序見表5。

表6 PCR 擴增反應體系

1.3.5 模擬橙汁摻雜柑橘汁試驗 制備鮮榨純橙樣品(新奇士)和純柑橘樣品(青橘)，將橙汁與柑橘汁按不同比例混合摻雜(V橙汁∶V柑橘汁分別為0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0)。對混合的果汁進行DNA提取和雙重實時熒光PCR擴增試驗。

1.3.6 雙重實時熒光PCR法可行性驗證 對市售飲料進行DNA提取和雙重實時熒光PCR擴增檢測，驗證雙重實時熒光PCR方法的可行性。

2 結果與分析

2.1 DNA提取質量

2.1.1 DNA純度 用Nano核酸蛋白分析儀對美國新奇士、倫晚臍橙、埃及橙、南非夏橙、廣西砂糖橘、云南丑柑、柑橘、沃柑、黑加侖、紅樹莓、黃樹莓、黃桃、藍莓、葡萄14種純水果DNA進行純度和質量濃度測定，所有樣品的DNA純度(OD260 nm/OD280 nm)均在1.7～2.1范圍之間，純度較好，DNA提取過程不存在污染，結果見表7。

表7 純水果樣品純度及質量濃度

2.1.2 DNA可擴增性 應用植物通用18S rRNA基因引物和探針對所提取的DNA樣品進行擴增，如圖1所示，所有樣品均擴增出典型的S型熒光曲線，陰性對照和空白對照均正常，結果表明所有樣品均有適合PCR擴增的DNA。

A. 黃樹莓 B. 紅樹莓 C. 黑加侖 D. 廣西砂糖桔 E. 黃桃 F. 云南丑柑 G. 埃及橙 H. 葡萄 I. 沃柑 J. 倫晚臍橙 K. 美國新奇士 L. 柑橘 空白. 超純水 陰性對照. 牛肉

2.2 R22引物、探針通用性

為確定所設計和篩選的R22引物和探針的通用性，首先使用典型的、具有代表性的純橙樣品(美國新奇士)和純橘樣品(廣西砂糖桔)來確定R22引物和探針對橙和橘的典型擴增曲線圖譜，結果見圖2。純橘樣品僅在FAM通道有擴增曲線，CT值約為14.51，熒光值約為3 373 161.750，在VIC通道無熒光擴增曲線。純橙樣品在VIC通道和FAM通道均有擴增曲線，CT值分別為22.97，23.24，熒光值分別為976 360.625，356 213.219，兩通道熒光比值(FAM/VIC)約為0.36，在0.5±0.2的范圍內。

圖2 純橙樣品、純柑橘樣品的熒光擴增圖譜

使用橙類的其他栽培品種(倫晚臍橙、埃及橙、南非夏橙)和橘類的其他栽培品種(云南丑柑、柑橘、沃柑)驗證R22引物和探針的通用性，結果見圖3。

圖3 橙類和柑橘類其他栽培品種的熒光擴增曲線結果

如圖3(a)所示，橙類的其他栽培種樣品的熒光擴增曲線和純橙(美國新奇士)的熒光擴增曲線相似，VIC通道和FAM通道均有熒光擴增曲線，CT值和熒光值如表8 所示，兩通道熒光比值(FAM/VIC)在0.5±0.2的范圍內。

如圖3(b)所示，橘類的其他栽培品種樣品的熒光擴增曲線和純橘(廣西砂糖桔)的熒光擴增曲線相似，僅在FAM通道有擴增曲線，VIC通道無熒光擴增曲線，FAM通道的CT值和熒光值如表8所示。

表8 橙類和柑橘類的其他栽培種熒光擴增CT值及熒光值

2.3 R22引物、探針的特異性

為確定所設計和篩選的R22引物和探針的特異性，使用R22引物和探針對黑加侖、紅樹莓、黃樹莓、黃桃、藍莓、葡萄6種非柑橘屬水果進行實時熒光PCR擴增，用典型樣品純橙(新奇士)和純橘(砂糖桔)做陽性對照，結果見圖4。R22引物和探針對黑加侖、紅樹莓、黃樹莓、黃桃、藍莓、葡萄6種非柑橘屬水果的實時熒光PCR擴增結果均為陰性，說明R22引物和探針對非柑橘屬類水果無擴增性，具有較好的特異性。

A. 砂糖橘 B. 新奇士 C. 黑加侖 D. 紅樹莓 E. 黃樹莓F. 黃桃 G. 藍莓 H. 葡萄 空白. 超純水

2.4 橙汁摻雜橘汁的模擬試驗

為確定R22引物和探針的檢測靈敏度，按不同的比例模擬橙汁摻雜橘汁試驗，混合樣品進行DNA提取后使用R22引物和探針進行實時熒光PCR擴增，擴增曲線見圖5，結果見表9。

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K依次對應V橙汁∶V柑橘汁為0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0的樣品 KB. 空白

表9 不同比例橙汁柑橘汁摻雜試驗結果

由圖5及表9可知，橙汁中摻雜10%及以上比例的橘汁樣品均有FAM通道熒光增強情況，且FAM/VIC通道熒光值比值>1，FAM通道熒光值并隨著橘汁摻雜的比例增加而增大。說明R22引物和探針可以靈敏地檢測到10%摻雜比例的橙橘樣品。

2.5 市售飲料檢測

對市售的13種橙汁飲料樣品和其他非橙汁飲料進行DNA提取和熒光PCR擴增，結果見圖6、圖7和表10。

A. 砂糖橘 B. 新奇士 C. 橙汁飲料1 D. 橙汁飲料2 E. 橙汁飲料3 F. 橙汁飲料4 G. 都樂橙汁 H. 匯源橙汁 I. 良珍橙汁 J. dana橙子果汁飲料 K. 酷兒橙汁飲料 L. 美汁源果粒橙

A. 砂糖橘 B. 新奇士 C. 粒粒橙 D. 咸柑橘飲料1 E. 咸柑橘飲料2 F. 芒果混合汁飲料 G. 藍莓汁飲料 H. 桑葚汁飲料

表10 橙汁飲料的熒光PCR擴增結果

由圖6和表10可知，10種僅含有橙汁成分的飲料均產生與純橙樣品(新奇士)相同的熒光擴增曲線，FAM/VIC熒光比值在0.5±0.2的范圍內，與純橙樣品的FAM/VIC熒光比值相符。由圖7和表10可知，3種橙橘混合飲料均有FAM、VIC通道PCR熒光擴增曲線，FAM/VIC熒光比值>1，檢測成分均與標簽標明的成分信息一致；其他非橙汁飲料無熒光擴增現象。說明所建立的雙重熒光定量PCR方法能夠檢測市售飲料中的橙和橘成分，適用于市售橙汁飲料的鑒偽。

3 結論

試驗研究的雙重實時熒光定量PCR法，在同一反應體系中，加入雙引物和雙探針，同時檢測兩個目的基因，實現一管多檢，省時省力，大大提高了檢驗的時效性。該法使用通道熒光比值判斷橙和橘成分，當FAM/VIC通道熒光比值在0.5±0.2的范圍時，說明僅含有橙成分，FAM/VIC熒光比值>1，則含有橘成分。與其他檢驗方法或標準使用實時熒光定量PCR方法檢驗時利用CT值判斷結果有所不同，打破了僅靠CT值判定結果的局限。

通過雙重熒光定量PCR方法，在設定的R22引物和探針以及反應體系下，實現了柑橘屬中橙和橘成分的區分。但試驗對市售飲料的檢驗品種覆蓋范圍有限，仍需進一步篩選和優化引物、探針和反應體系，擴大飲料檢驗品種，進一步尋找特色的規律，建立果汁中單一植物源性成分的靶向精準鑒別技術，完善果蔬汁飲料鑒別的標準方法。