苦蕎CCT基因家族生物信息學及表達分析*

石桃雄，趙佳利，田 桃，陳慶富，鄧 嬌

(貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心，貴州貴陽 550001)

0 引言

蕎麥是一種廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill.)的雙子葉小雜糧作物，甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn.)是其常見的兩個栽培種[1]。苦蕎含有豐富的多酚化合物、類黃酮和不飽和脂肪酸等生物活性物質，能夠降低膽固醇、抑制腫瘤、調節高血壓、抗炎和治療糖尿病等[2,3]。此外，苦蕎還含有豐富的蛋白質、氨基酸、多種維生素和纖維素等成分，是谷類作物中唯一具有七類營養物質的作物[4]。因此，苦蕎是一種很好的藥食兩用作物，具有非常高的藥用價值和營養價值，且具有廣泛的環境適應能力，能帶來良好的經濟效應[3,5,6]。

花期是植物生命周期中一個十分重要的發育階段，對經濟作物的生態適應性、產量和品質等有著非常重要的影響。苦蕎花期的早晚與產量呈極顯著負相關關系[7]，因此研究蕎麥開花的調控機理對提高苦蕎產量至關重要。據報道，植物CCT(即CO、COL和TOC1)轉錄因子家族具有調控花期、生物鐘和響應光周期等功能[8,9]。此外，CTT基因還通過激素信號轉導途徑參與抵抗干旱、鹽、高溫、低溫等非生物性脅迫，減少這些非生物性脅迫對植物造成的危害[10,11]。因此CCT基因在植物的生長發育及抗逆境脅迫方面發揮著重要的作用。

CCT基因編碼的蛋白都含有CCT結構域，是由CO-LIKE蛋白、CONSTANS (CO)蛋白和TIMING OF CABl (TOCl)蛋白的C末端的43個保守的氨基酸殘基組成[12]。根據保守結構域的不同，CCT基因家族分為3個亞家族，分別為CONSTANS-like(COL)亞家族、CCTmotif (CMF)亞家族和PRR亞家族。COL亞家族所編碼蛋白均包含1-2個B-box結構域和1個CCT結構域，CMF亞家族所編碼蛋白僅含有1個CCT結構域，而PRR亞家族所編碼蛋白均含有1個CCT結構域和1個Receiver-like (REC)結構域[13]。目前，CCT基因家族已在擬南芥[14]、水稻[8]、小麥[11]、玉米[15]和毛竹[16]等多個物種中被報道。擬南芥的CCT基因家族有40個成員，其中CO基因是最先被發現的，它在長日照條件下能促進開花，突變后擬南芥表現出晚花性狀[17]；TOC1基因通過晝夜節律調控開花光周期[18]；COL1基因在抵抗鹽、干旱和溫度等非生物脅迫中起到重要作用[14]。水稻中有41個CCT基因，最新研究發現至少有18個成員參與了水稻的開花過程，其中有4個新發現的成員參與抽穗期的調控；3個基因OsCCT22、OsCCT38和OsCCT41表現出在長日照條件下抑制開花，在短日照條件下促進開花的作用，而OsCCT03在長、短日照條件下均能促進水稻開花[8]。玉米中的CCT基因家族成員比其他物種稍多，共有57個，其中有15個成員與花期顯著相關[15]，而且ZmCOL3基因對開花、莖節數、總葉片株高和穗位高均有影響，呈現出多功能的特點[19]。

在模式植物和大宗作物中CCT基因家族調控花期的研究報道已有不少，但在蕎麥中還未見報道。本研究利用生物信息學工具對苦蕎CCT基因家族進行全基因組范圍的鑒定，并對其理化特性、染色體定位、基因結構、保守基序、保守結構域、系統進化和表達模式等進行分析，擬為進一步探究苦蕎CCT基因家族功能，并利用該基因家族改良蕎麥品種奠定基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 苦蕎基因組中CCT基因的篩選及理化性質分析

苦蕎品種‘cv.Pinku1’ 的基因組測序數據及其注釋信息均從NCBI基因組數據庫下載(http://www.mbkbase.org/Pinku1/)。從擬南芥信息資源數據庫TAIR (https://www.arabidopsis.org/)下載CCT基因家族序列作為本地BLAST的參考序列(query序列)。運用TBtools(v1.082)軟件進行BLAST比對，得到苦蕎CCT基因家族候選序列。再運用 Conserved Domain Database (CDD)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structu- re/bwrpsb.cgi)對這些CCT基因的結構域進行分析，從候選序列中篩選出含有CCT結構域的序列，確認為苦蕎的CCT基因家族成員。

運用ExPaSy提供的在線Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)，分析苦蕎CCT基因編碼的蛋白質的理化性質，包括氨基酸殘基的個數、相對分子量、等電點和親水性等。

1.2 CCT基因染色體分布

運用TBtools (v1.082)軟件繪制苦蕎CCT基因在染色體上的分布圖并對其進行共線性分析。

1.3 CCT基因結構、保守基序及結構域分析

首先運用MEME在線工具(http://meme-suite.org/)分析苦蕎CCT蛋白的氨基酸序列的保守基序，基序個數設置為10個；然后用TBtools(v1.082)軟件將預測結果xml文件進行可視化；最后利用TBtools(v1.082)軟件分析苦蕎CCT基因結構，并利用CDD數據庫分析CCT基因保守結構域。

1.4 CCT基因家族系統進化樹構建

利用MEGA 7.0軟件的Cluster W程序對苦蕎和擬南芥的CCT基因家族進行多序列比對，采用Neighbor Joining (NJ)法構建系統進化樹。

1.5 苦蕎CCT基因的表達分析

采用Zhang等[20]發表的苦蕎‘cv.Pinku1’的轉錄組數據，根據4種組織(根、莖、葉和花)中的FPKM值，利用TBtools(v1.082)軟件繪制CCT基因表達水平的熱圖。

2 結果與分析

2.1 苦蕎CCT基因家族成員的鑒定及在染色體的定位

以擬南芥40個CCT基因家族成員為參考序列，并結合CCT基因家族特有的CCT結構域，在苦蕎基因組數據庫中共鑒定出35個CCT基因家族成員。染色體定位分析表明，苦蕎35個CCT基因在8條染色體上均有分布，其中7號染色體上分布的CCT基因數目最多，有9個；其次是8號染色體上，分布了8個成員(圖1)。分別有5個、4個和3個CCT基因定位在2號、1號和5號染色體上。3號、4號和6號染色體上各分布了2個CCT基因。共有8對CCT基因發生片段復制現象(圖1)，分別為FtPinG0006138300.01.T01和FtPinG0004072200.01.T01、FtPinG0004072200.01.T01和FtPinG0009564600.01.T01、FtPinG0009564600.01.T01和FtPinG0003531700.01.T01、FtPinG0001582600.01.T01和FtPinG0004578000.01.T01、FtPinG0008789300.01.T01和FtPinG006802300.01.T01、FtPinG0008422500.01.T01和FtPinG0007624400.01.T01、FtPinG0007624400.01.T01和FtPinG0004084100.01.T01以及FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0008422500.01.T01。

圖1 苦蕎FtCCT基因在染色體上的分布及片段復制

2.2 苦蕎FtCCT系統發育、基因結構、保守基序及結構域

系統發育分析可將苦蕎35個CCT基因分成三大類(圖2a)，共含有10個保守基序(圖2b)。第Ⅰ類包含了大部分成員，共26個，又可細分為4小組：第1小組有10個CCT基因，除FtPinG0004084100.01.T01和FtPinG0007042800.01.T01只含有Motif 1，其他都含有Motif 1和Motif 8；第2小組含4個成員，除FtPinG0005510100.01.T01缺少Motif 10，其他3個都具有4個Motif (Motif 1、Motif 5、Motif 6、Motif 10)；第3小組由4個CCT基因組成，其中FtPinG0005690000.01.T01只含有Motif 1，其他3個含有Motif 1 和Motif 2；第4小組由8個成員組成，其中FtPinG0006138300.01.T01僅含有Motif 1，FtPinG0006374000.01.T01含有Motif 1、Motif 2，其他6個CCT基因由Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 9 組成。第Ⅱ類由6個CCT基因組成，其中2個CCT基因僅含有Motif 7，2個含有Motif 1和Motif 7，還有2個含有Motif 1、Motif 2和Motif 7。第Ⅲ類只有3個CCT基因成員，都含有Motif 1、Motif 5和Motif 10 (圖2a,b)。

35個苦蕎CCT基因中，6個CCT基因(FtPinG0004084100.01.T01、FtPinG0007042800.01.T01、FtPinG0005690000.01.T01、FtPinG0006138300.01.T01、FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)只含有1個基序，其他29個CCT基因含有2-4個基序(圖2a,b)。除了兩個成員(FtPinG0009634400.01.T01和FtPinG0004756400.01.T01)不具有Motif 1,其他33個CCT基因成員都具有Motif 1，占比達到94%；12個CCT基因成員具有Motif 2的基因，比例為34%。這說明Motif 1和Motif 2可能為苦蕎CCT基因家族最保守的基序(圖2b)。在Pfam數據庫中(http://pfam.xfam.org/)，Motif 1被注釋為CCT結構域，Motif 2和Motif 4被注釋為B-box結構域，Motif 3和Motif 6被注釋為和調節信號響應相關的結構域，Motif 5被注釋為GATA zinc finger，Motif 10被注釋為tify結構域，Motif 7、Motif 8和Motif 9的注釋未知。

圖2 苦蕎FtCCT基因家族的系統發育樹(a)、保守基序(b)及基因結構(c)

苦蕎的35個CCT基因內含子數目為1-8，其中FtPinG0005619800.01.T01含有的內含子數目最多，有8個；其次是FtPinG0005184600.01.T01、FtPinG0007821700.01.T01和FtPinG0002597300.01.T01(均位于第Ⅰ類第2小組中)，均含有7個內含子(圖2c)，9個CCT基因成員只有1個內含子。

苦蕎CCT基因家族所編碼蛋白中含有5種主要的保守結構域，分別是CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC (圖3)，其中CTT結構域在所有苦蕎CCT基因編碼蛋白中都有出現，說明該結構域在植物進化過程中高度保守。苦蕎CCT基因家族中的CMF亞家族的成員最多(18個)，此亞族所編碼的蛋白都含有1個CCT結構域，其中還有3個含有tify結構和Znf-GATA結構域，并且這3個蛋白的大小相似；COL亞家族由13個CCT基因組成，所編碼蛋白中除了4個成員只含有1個B-box和1個CCT結構域外，其他成員都含有2個B-box和1個CCT結構域；PRR亞家族中的CCT基因數目最少，只有4個，所編碼蛋白由1個CCT和1個REC結構域組成。

圖3 苦蕎FtCCT基因家族保守結構域

2.3 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質

對35個FtCCT基因編碼的蛋白質的理化性質分析表明，CCT基因家族編碼的蛋白質含有117-753個氨基酸殘基，相對分子質量為4 082.90-82 741.52 Da，預測的理論等電點為4.96-9.51，且以偏酸性和中性居多。預測的苦蕎CCT基因家族蛋白質的親水指數均為負值，表明蛋白質均屬于親水性蛋白，其中以FtPinG0007624400.01.T01的親水性最強，平均親水指數為-9.180 (表1)。

表1 苦蕎FtCCT基因家族的理化性質

續表1

2.4 苦蕎FtCCT基因家族進化分析結果

系統進化分析發現苦蕎和擬南芥CCT基因家族成員可分為三大類：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(圖4)。其中，Ⅰ類中的基因數目最豐富，由29個擬南芥CCT基因和22個苦蕎CCT基因組成，可以進一步分為 ⅠA和 ⅠB兩個亞類；Ⅱ類包含8個擬南芥和10個苦蕎的CCT基因成員；Ⅲ類中擬南芥和苦蕎各3個CCT基因成員。

根據姚新轉等[21]對擬南芥CCT基因家族的分類方法，可以將苦蕎的35個CCT基因家族分為COL、CMF和PRR 3個亞家族(圖4)，與圖3的結果基本一致。其中CMF亞家族包含了分布在進化樹上的Ⅱ類和Ⅲ類中的全部CCT成員，以及IA和IB兩個亞類中的小分支；COL亞家族主要分布在進化樹中的IA亞類以及IB亞類中的一個分支上；PRR亞家族由IB的一個分支組成。

圖4 苦蕎和擬南芥CCT基因家族系統進化

2.5 苦蕎CCT基因家族在組織中的表達模式

苦蕎35個CCT基因在根、莖、葉和花4個組織中的表達模式如圖5所示，有5個CCT基因在根中表達水平高，推測可能與根的生長發育調控有關；只有1個CCT基因在莖中顯著高表達，推測其可能參與莖的生長發育過程。在葉中表達水平較高的CCT基因的數目較多，而且大多數是CMF亞家族成員，他們可能參與葉的生長發育與光形態建成。在花中表達水平較高的CCT基因的數目也較多，主要是COL和CMF亞家族成員，這些基因可能參與調控開花過程，比如開花時間、花期長短等。

圖5 苦蕎CCT基因家族在不同組織中的表達模式

3 討論

植物CCT基因家族在調節植物的生長發育和抗逆境脅迫中起著至關重要的作用，并且大多數成員參與開花調控，與作物的產量也息息相關[8,16,22,23]。本研究在全基因組水平上共鑒定到35個苦蕎FtCCT基因，數目與其他物種相差不大，含有1-8個內含子(圖2)。這些苦蕎CCT蛋白等電點為4.96-9.51，絕大多數以酸性為主，均為親水性蛋白(表1)。35個苦蕎FtCCT基因在8條染色體上均有分布，且8對FtCCT基因發生了片段復制事件(圖1)。片段重復在CCT基因家族成員的擴增中可能起著重要的作用，推測這些同源性較高的復制基因具有相似的生物學功能。苦蕎CCT蛋白與其他物種一樣含CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結構域(圖3)。所有的苦蕎CCT蛋白都含有CCT結構域，說明該結構域在植物進化過程中高度保守。

為更好地了解苦蕎FtCCT基因家族成員的分類和可能具有的功能，本研究將40個擬南芥AtCCT家族成員與35個苦蕎FtCCT家族成員進行蛋白序列比對并構建系統進化樹(圖4)。結果表明，兩者的CCT基因具有較高的同源性，說明CCT基因在物種間比較保守，可能具有相似的功能。根據姚新轉等[21]對擬南芥AtCCT基因家族的分類方法，苦蕎的35個FtCCT基因家族也可以分為COL、CMF和PRR 3個亞家族，且CCT基因家族的功能可能與Motif以及結構域相關。Putterill等[17]研究表明，擬南芥的AtCO基因(At15840.1)屬于COL亞家族，具有促進開花的功能，苦蕎中兩個AtCO同源基因FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01在花組織中具有較高的表達水平(圖5)，因此推測FtPinG0008999600.01.T01和FtPinG0009408600.01.T01可能具有相似的功能，并且苦蕎的COL亞家族的12個成員中有7個在花組織中高表達(圖5)，這與擬南芥的COL亞家族中的大部分成員參與擬南芥開花時間的調控一樣[18]。屬于擬南芥PRR亞家族的TOC1被報道影響晝夜節律[24]，苦蕎中的同源基因FtPinG0005510100.01.T01可能也參與生物鐘的調控。PRR亞家族的4個成員中有2個在花中高表達，在根和葉中各有1個表達水平較高(圖5)，因此，不同的成員可能對不同組織的生長發育起著調控作用。CMF亞家族對谷類作物的馴化和適應起著重要作用，且對開花起著抑制作用[25,26]，而苦蕎中的CMF亞家族的成員最豐富，其中有8個成員在葉中高表達，有6個在花中高表達，還有少數成員在根和莖中具有較高的表達水平，這些基因可能調控不同組織的生長發育。因此，苦蕎CCT基因家族中的有些成員可能與擬南芥的同源基因具有相似的功能，而特異的Motif和結構域可能是不同亞家族成員之間功能差異的主要原因。

4 結論

植物CCT基因家族在調節植物的生長發育、花期和抗逆境脅迫中起著至關重要的作用。本研究在全基因組水平上共鑒定出35個苦蕎CCT基因，在8條染色體上均有分布。苦蕎CCT基因編碼的蛋白的等電點為4.96-9.51，絕大多數以酸性為主，均為親水性蛋白。基于CCT、B-box、Znf-GATA、tify和REC等5種主要的保守結構域，將苦蕎的CCT基因家族劃分為CMF、COL和PRR 3個亞家族。苦蕎和擬南芥CCT基因具有較高的同源性。在葉和花中高表達的CCT基因數目較多，推測這些基因可能參與了生長發育、光形態建成或開花調控過程。以上研究結果為進一步探究苦蕎CCT基因家族功能，以及利用該基因家族改良蕎麥花期奠定了基礎。