氨基酸輔助合成棒狀羥基磷灰石及其載銀抑菌性能的研究

王建榮 陳金弟

摘要：羥基磷灰石是一種磷酸鈣生物陶瓷， 與人體自然骨和牙齒等硬組織中的無機質在化學成分和晶體結構上具有相似性，是一類重要的骨修復材料。本文以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O為原料合成羥基磷灰石，以L-胱氨酸為表面修飾劑對羥基磷灰石進行表面修飾，將納米銀負載在其表面。通過紫外-可見分光光度法研究載銀后羥基磷灰石的抑菌性，并通過X射線衍射（XRD），掃描電鏡（SEM），紅外光譜（FT-IR）對樣品的結構與成分進行表征分析。結果顯示，用氨基酸修飾后得到的羥基磷灰石顆粒呈棒狀，尺寸均勻，負載納米銀前后結構沒有發生變化，通過抑菌實驗表明在其表面負載納米銀后，材料的抑菌性得到極大改善，從而大大提高了醫學使用價值。因此，載銀后的棒狀羥基磷灰石在醫學領域具有廣闊的應用前景。

關鍵字：? 羥基磷灰石? 生物復合材料? 表面修飾 抑菌性

1.前言

羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是天然骨的主要無機成分，其基本單元是羥基磷灰石晶體，長度為20-40 nm。厚度為1.5-3nm[1]。HA具有良好的生物活性和生物相容性，植入人體后能在短時間內與人體的軟硬組織形成緊密結合，是一種性能非常優良的骨修復材料[2]。臨床研究證明，羥基磷灰石顆粒過松散，不能凝結成形，使用時操作極為不便，在骨創面易發生植入材料的流失，且力學性能較差，抗彎強度和斷裂韌性指標均低于人體致密骨，限制了它們單獨在人體負重部位的使用[3]。本文對表面修飾劑修飾后的羥基磷灰石進行研究。

2. 實驗部分

2.1.羥基磷灰石復合材料的制備

（1）羥基磷灰石的制備

稱取適量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例稱取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例為1.67）待其完全溶解后配置一定濃度的氫氧化鈉溶液調節PH=9，在磁力攪拌器上攪拌24h，燒杯口用保鮮膜密封。將上述的反應產物至于鼓風干燥箱里干燥，完全干燥后在研缽中研細，再在馬弗爐中900℃煅燒45min。

（2）羥基磷灰石的表面修飾

稱取適量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例稱取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例為1.67）待其完全溶解后配置一定濃度的氫氧化鈉溶液調節PH=9，在加入適量L-胱氨酸后充分攪拌，在磁力攪拌器上攪拌24h，燒杯口用保鮮膜密封。將上述的反應產物至于鼓風干燥箱里干燥，完全干燥后在研缽中研細，再在馬弗爐中900℃煅燒45min。

（3）負載納米銀

取上述產物0.9085g溶于一定量的蒸餾水中，置于超聲清洗器中超聲30min，在冰浴中冷卻至4℃，按5：1稱取AgNO3溶于水中配成溶液加入上述溶液中;取0.1319gNaBH4溶于20ml水中（水的溫度應控制在4℃），用膠頭滴管緩慢將NaBH4溶液加入使其在40min內滴完。

將反應后的混合液轉移至離心管中進行離心，將下層沉淀用水清洗兩遍后于真空干燥箱中干燥，待完全干燥后密封保存。

3.分光光度法測抑菌性

用移液槍移取60ml的液體培養基于2個錐形瓶中，經高壓滅菌鍋滅菌后，用接種環取少量菌放于錐形瓶中，恒溫培養一段時間，即得到二代菌液（以上操作均在無菌環境下進行）。

用移液槍分別移取40ml的液體培養基于6個錐形瓶中，編號為1、2、3、4、5、6，用報紙密封后置于高壓滅菌鍋滅菌。然后放到凈化臺中待用。

其中，將未加入藥品的1、4組為對照組，將6個錐形瓶用棉塞塞緊，置于37℃的恒溫振蕩器中培養，每隔30min取上清液測一次OD600，在測定過程中，盡量避免培養液在空氣中的暴露時間。記錄實驗數據，然后以OD600 為縱坐標，以時間為橫坐標繪制細菌生長曲線。

4.結果與分析

4.1 紅外光譜分析（FT-IR）

圖1為樣品的紅外光譜圖，如圖所示，三組樣品的紅外光譜的波形相似，譜中主要峰的位置相同。譜線a與b在3431、1631、1084、1049、608、561 cm-1等位置出現了較強的峰，其中1631、608、561cm-1處為強而窄的峰。c曲線與其他兩條不同，雖然出峰位置相同，但是在再3431cm-1處為寬而弱的峰。理論上，PO4-3有四種振動方式，分別在紅外光譜中會出現四組峰，v1峰在960 cm-1附近，ν2峰位于470-440 cm-1區域，ν3位于1190-976 cm-1 區域，ν4峰位于600-560 cm-1區域[4]。因此，561、608、1049和1084 cm-1的強峰是nHA中PO4-3產生的特征峰。1631 cm?1處特征峰是H2O的振動峰，表明粉末樣品表面吸附少量的水分。3431cm?1 位置的峰可能歸因于樣品中的-OH、-NH2、H2O等，譜線b在3431 cm-1處的峰寬而強，-NH2的特征峰理論上在1400-1420 cm?1區間，可能的原因是經過煅燒后樣品表面的氨基酸沒有被煅燒完全或者是氨基酸在表面轉化-NH4+，但是在譜圖1400-1420 cm?1區間內中沒有出現峰，說明LC-HA樣品中大量的氨基酸在煅燒后被除去，。譜線c中在3431 cm-1、1631 cm?1的峰與b、c相比，強度較弱，說明Ag- LC-HA中的結晶水含量較少。

4.2掃描電鏡譜圖分析

圖2為羥基磷灰石（HAP）、用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石LC-HA （HAP-Aa）、負載了納米銀的羥基磷灰石（Ag- LC-HA） 的掃描電鏡，從圖a可以看出羥基磷灰石的形貌均一，尺寸均勻。圖b用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石的形狀趨向于長為40-60nm，寬為20nm的棒狀，說明L-胱氨酸作為表面修飾劑修飾的效果比較好。圖c為將納米銀負載在LC-HA表面，可以觀察到納米銀顆粒附著在Ag-HA的表面，且分布稀疏。與圖b相比，其棒狀的結構沒有發生變化，說明載銀前后對羥基磷灰石的結構并未產生影響。

4.3 X射線衍射（XRD）

圖3為羥基磷灰石（HA）、用L-胱氨酸表面修飾后的羥基磷灰石（LC-HA）、負載了納米銀的羥基磷灰石（Ag- LC-HA）的X衍射圖譜。圖中a、b、c譜線在2θ為25.7、32、33、47、50附近均出現衍射峰，理論上，羥基磷灰石的XRD圖譜中，2θ=25.7、31.6、32.7、33.8、40、47.1、49.8、53，表示一個完整的羥基磷灰石結構[5-8]，說明三組樣品中均含有羥基磷灰石晶體。a、b中譜線X射線衍射峰較弱且峰形相似，說明此時結晶程度較差，用L-胱氨酸表面修飾后樣品的本身結構沒有變化，表面改性只是發生在納米材料的表面，只是表面形貌發生了變化。經查PDF卡片[8]可知，銀的衍射峰大約2θ為28、34、37、43處，c中譜線較為尖銳，說明其結晶程度較好。

4.4抑菌性實驗分析

圖4細菌生長曲線，細菌在液體培養基中的生長呈現S形對數生長，包含四個階段，即誘導期、對數期、穩定期、衰減期。生長曲線直觀的反映了細菌的量隨時間而變化的過程與規律，同時包含了許多種群生態學的信息與特征。根據生長曲線可以求出瞬時生長率，利用生長曲線的變化可以揭示藥物的抑菌效果，反映微生物群體生長規律，從生長曲線可知微生物對環境的適應快慢程度、微生物對培養基成分的利用情況、藥物中不同成分對微生物產生的不同作用以及藥物最強與最弱的時間等多種有意義的信息。

根據圖中細菌生長曲線，對羥基磷灰石表面修飾后其抑菌性能并沒有變化，說明L-胱氨酸對羥基磷灰石修飾后的產物沒有抑菌性能，將納米銀負載到其表面后，細菌的生長曲線趨近于直線，液體培養基中的細菌數量沒有變化，說明負載了銀后的樣品可以作為一種新型的材料運用到醫學領域。

5.結論

通過化學沉淀法，以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O為原料制備得到羥基磷灰石，添加L-胱氨酸后得到的樣品在馬弗爐中900℃煅燒45min后，有利于獲得尺寸均勻，形狀為棒狀的納米羥基磷灰石顆粒。表征后證實L-胱氨酸并不存在于樣品中，說明經過熱處理后L-胱氨酸被完全除去了。通過化學還原法在棒狀納米羥基磷灰石表面負載納米銀，其中以NaBH4為還原劑，AgNO3為反應前軀體得到納米銀溶膠，然后將納米銀溶膠轉移到用L-胱氨酸修飾后的羥基磷灰石的表面上，載銀前后羥基磷灰石的結構基本沒有發生改變， Ag+部分吸附在 HA表面或進入HA晶格， 取代了Ca2+， 另一部分形成了Ag3PO4晶體。在細菌生長環境中加入負載了銀的藥品后，細菌生長曲線趨近于直線，表明細菌在添加了載銀羥基磷灰石后的培養液中的生長被抑制，表明復合材料對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有很強的抗菌性能。

參考文獻

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