循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)直腸癌術(shù)前放化療患者療效及預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

韋斌,鐘曉剛, 麥威,黃順榮,牙韓清,王曉通

直腸癌是臨床常見(jiàn)病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素作用的結(jié)果，包括免疫因素、遺傳因素、生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等[1-3]。全球患病率均較高，每年新發(fā)病例超過(guò)140萬(wàn)，以東歐、亞洲國(guó)家居多[4]。近年來(lái)，我國(guó)直腸癌初篩檢出率達(dá)19.47%，直腸癌根治術(shù)及術(shù)后放療、化療在該病治療中應(yīng)用廣泛，但術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率仍較高，導(dǎo)致病死率高[5]。研究表明，術(shù)前新輔助放療、化療能夠促進(jìn)瘤體縮小，改善局部水腫，減輕炎性反應(yīng)，提升手術(shù)療效[6]。然而，部分患者對(duì)新輔助干預(yù)不敏感，導(dǎo)致療效、預(yù)后欠佳，現(xiàn)階段主要通過(guò)影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物等對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶、瘤體復(fù)發(fā)時(shí)，病情扭轉(zhuǎn)難度大[7-8]，因此，臨床還需尋求更理想的方式預(yù)測(cè)療效與預(yù)后。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)可通過(guò)腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移病灶脫落，釋放入血并參與血液循環(huán)，與直腸癌預(yù)后密切相關(guān)，經(jīng)CTC檢測(cè)甚至可發(fā)現(xiàn)影像學(xué)無(wú)法發(fā)現(xiàn)的早期微轉(zhuǎn)移[9]。基于此，本研究分析CTC對(duì)直腸癌術(shù)前放療、化療患者療效、預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，進(jìn)一步了解CTC判斷直腸癌患者病情改善與進(jìn)展的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年9月—2019年6月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸疝腸瘺外科收治直腸癌患者136例，患者術(shù)前均行新輔助放療、化療，其中男78例，女58例，年齡38～73(58.63±11.98)歲；病程3～12(8.32±3.09)個(gè)月；直腸癌誘因：高脂肪、低纖維膳食67例，肥胖62例，其他7例；合并基礎(chǔ)疾病：糖尿病27例，高血壓32例；家族遺傳史21例；吸煙史39例；飲酒史31例；腫瘤直徑2～8(5.43±2.15)cm；臨床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期66例，Ⅲ期36例；分化程度：低分化32例，中/高分化104例；腫瘤形態(tài)：潰瘍型82例，浸潤(rùn)型33例，隆起型16例，其他5例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：2015GXZZRMYY)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為直腸癌者[10]；②病理分期為Ⅰ～Ⅲ期，行根治手術(shù)治療，術(shù)前進(jìn)行新輔助放療、化療者；③初診患者；④精神狀態(tài)正常，溝通良好者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)患有其他部位的原發(fā)性腫瘤者；②因直腸癌復(fù)發(fā)入院就診者；③出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④患全身炎性疾病者；⑤患血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病者；⑥長(zhǎng)期使用抗凝藥物者；⑦心、肺等臟器嚴(yán)重受損者。

1.3 治療方法 所有患者術(shù)前行新輔助放療、化療。(1)放療：患者仰臥位，充盈膀胱，經(jīng)3DCRT技術(shù)實(shí)施放療，針對(duì)病灶原發(fā)部位、局部淋巴引流區(qū)、高危復(fù)發(fā)區(qū)域進(jìn)行治療，總劑量為45.0～50.4 Gy，每次劑量為1.8～2.0 Gy，共計(jì)26～28次。(2)化療：采用Folfox6方案行同步化療，奧沙利鉑(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)85 mg/m2靜脈滴注，第1天；四氫葉酸(赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司)400 mg/m2靜脈推注，第1天；氟尿嘧啶(山西普德藥業(yè)股份有限公司)400 mg/m2靜脈滴注，第1天，之后調(diào)整為1 200 mg/m2，每日1次，靜脈滴注2 d，同步化療2個(gè)周期，輔助化療2～4個(gè)周期。(3)手術(shù)方式:均為傳統(tǒng)開(kāi)腹或腹腔鏡直腸癌根治術(shù)。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 臨床/病理特征：指導(dǎo)患者完善影像學(xué)檢查，搜集記錄患者臨床/病理相關(guān)資料，包括性別、年齡、病程、誘因、吸煙史、飲酒史、合并基礎(chǔ)疾病、家族遺傳史、脈管癌栓、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、腫瘤形態(tài)等。

1.4.2 CTC檢測(cè)：(1)CTC富集，采集患者治療前空腹肘靜脈血4 ml，在4 h內(nèi)富集；取PBS液5 ml置于離心管，將富集后的靜脈血標(biāo)本置入，經(jīng)PBS液清洗2次，取清洗液離心15 min，分離隔膜上層液體，將其置于新的離心管中，經(jīng)PBS液清洗2次，取清洗液離心10 min，棄上清液，取Fc封閉液40 μl加入，混勻，在4℃條件下反應(yīng)5 min，另取抗EpCAM抗體包被磁珠40 μl加入，清洗2次，重懸磁珠，將細(xì)胞與磁珠充分混合，在4℃下反應(yīng)2 h；最后啟動(dòng)IsoFlux分選設(shè)備，對(duì)CTC進(jìn)行富集。(2)CTC鑒定，取福爾馬林液40 μl固定富集后樣本，時(shí)間為20 min，洗滌棄上清，取10%驢血清40 μl加入，封閉5 min，棄上清，取 1%兔源抗CD45抗體40 μl加入，反應(yīng)20 min，洗滌棄上清，取0.5%驢抗兔CyTM3共軛抗體40 μl加入，避光條件下反應(yīng)20 min，棄上清，取0.2%Triton X-100 100 μl加入，透膜5 min，棄上清，取10%抗CK-FITC結(jié)合抗體40 μl加入，避光下反應(yīng)40 min，洗滌，棄上清，染色1 min，棄上清，重懸樣本；利用磁鐵對(duì)重懸后樣本進(jìn)行吸附，風(fēng)干，經(jīng)蓋玻片蓋住，樹(shù)膠封片，由專業(yè)人員鑒定，并進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)。(3)陽(yáng)性評(píng)價(jià)[10]，經(jīng)光學(xué)顯微鏡分析細(xì)胞形態(tài)，若細(xì)胞直徑>12 μm，且主要呈長(zhǎng)形或圓形，細(xì)胞形態(tài)完整，則視為陽(yáng)性。

1.4.3 預(yù)后評(píng)估：隨訪18個(gè)月，分析患者的總生存率，分析CTC對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1.5 新輔助治療效果評(píng)價(jià)：待新輔助治療結(jié)束后，評(píng)估療效。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]：利用MR、CT等方式觀察病灶最大徑，將療效分為以下4個(gè)等級(jí)：(1)完全緩解，瘤體完全消除；(2)部分緩解，瘤體縮小≥30%，但未達(dá)100%；(3)穩(wěn)定，瘤體縮小不足30%，或增加不足20%；(4)進(jìn)展，瘤體增長(zhǎng)≥20%，或有新病灶形成。總緩解率=(完全緩解+部分緩解)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 不同CTC表達(dá)直腸癌患者臨床/病理特征比較 136例患者中，CTC陽(yáng)性表達(dá)84例(61.8%)為CTC陽(yáng)性組，陰性表達(dá)52例(38.2%)為CTC陰性組。CTC陽(yáng)性組臨床分期Ⅲ期、低分化占比高于CTC陰性組(P<0.05)，但2組性別、年齡、病程、誘因、吸煙史、飲酒史、合并基礎(chǔ)疾病、家族遺傳史、腫瘤直徑、腫瘤形態(tài)、脈管癌栓等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同CTC表達(dá)2組直腸癌患者臨床/病理特征比較 [例(%)]

2.2 2組新輔助治療療效比較 CTC陽(yáng)性組總緩解率為33.33%，低于CTC陰性組的51.92%(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 2組直腸癌患者新輔助治療療效比較 [例(%)]

2.3 2組患者預(yù)后比較 患者隨訪18個(gè)月，無(wú)失訪病例，CTC陽(yáng)性組總生存率為84.52%(71/84)，低于CTC陰性組的96.15%(50/52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.427，P=0.035)。

2.4 不同療效及預(yù)后患者CTC計(jì)數(shù)比較 根據(jù)患者新輔助治療療效分成緩解組(n=55)、未緩解組(n=81)，緩解組CTC計(jì)數(shù)為(2.82±0.96)個(gè)，低于未緩解組的(6.63±2.75)個(gè)(t=9.865，P=0.000)。根據(jù)患者預(yù)后分成生存組(n=121)、死亡組(n=15)，生存組CTC計(jì)數(shù)為(2.73±0.85)個(gè)，低于死亡組的(6.49±2.81)個(gè)(t=11.322，P=0.000)。

2.5 CTC計(jì)數(shù)對(duì)患者療效、預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 CTC計(jì)數(shù)評(píng)估患者新輔助治療療效的曲線下面積(AUC)為0.764，CTC計(jì)數(shù)評(píng)估患者預(yù)后的AUC為0.794，見(jiàn)表3、圖1。

表3 CTC計(jì)數(shù)對(duì)直腸癌患者療效、預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

2.6 直腸癌患者預(yù)后的COX多因素分析 經(jīng)COX多因素回歸模型對(duì)相關(guān)變量行量化賦值，臨床分期、分化程度、CTC表達(dá)情況作為自變量X，以預(yù)后作為因變量Y(生存=0，死亡=1)，結(jié)果提示，臨床分期高、分化程度低及CTC高表達(dá)是直腸癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 直腸癌患者預(yù)后的COX多因素分析

注：CTC.循環(huán)腫瘤細(xì)胞

3 討 論

目前，臨床針對(duì)直腸癌仍主張采用綜合治療方案，即在無(wú)根治性手術(shù)治療禁忌的情況下行手術(shù)治療，并采用放療、化療等結(jié)合的方式進(jìn)行干預(yù)，改善患者病情[12-14]。即便如此，Ⅰ期、Ⅱ期患者仍約有10%、20% 5年內(nèi)病情呈現(xiàn)進(jìn)展趨勢(shì)，提示在直腸癌患者診治時(shí)可能已出現(xiàn)隱匿性轉(zhuǎn)移，但未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)[15]。研究表明，CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中不可或缺的條件，在原發(fā)腫瘤初期，腫瘤細(xì)胞已參與血液循環(huán)，CTC對(duì)腫瘤細(xì)胞具有播散作用，可促使其到達(dá)骨、肝、腦等部位并定植、生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移病灶，影響預(yù)后[16-18]。既往研究提示，CTC在肺癌、乳腺癌等患者的外周血內(nèi)均有表達(dá)，與干細(xì)胞特性相似，能夠不斷增殖、更新，轉(zhuǎn)移功能、侵襲能力強(qiáng)[19-21]。鑒于此，臨床可考慮采用CTC對(duì)直腸癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

本研究顯示，在136例患者中，CTC陽(yáng)性率高達(dá)61.76%，這類患者可能已發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移。通過(guò)臨床病理特征分析提示，CTC陽(yáng)性患者的臨床分期Ⅲ期、低分化率較陰性患者明顯增高，表明直腸癌病情越重，CTC陽(yáng)性率越高。張?bào)銝|等[22]針對(duì)胃癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CTC表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；郭華等[23]以結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)CTC表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期存在關(guān)聯(lián)，以上研究均佐證了本研究結(jié)果。具體原因可能為：CTC主要源于腫瘤病灶組織，其表達(dá)情況能反映患者腫瘤負(fù)荷程度，是引起腫瘤血行轉(zhuǎn)移的重要原因，臨床分期越高、分化程度越低的患者腫瘤負(fù)荷越重，可能促使CTC生成增多，致其陽(yáng)性表達(dá)率增高[24-26]。

CTC在原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移病灶中均可見(jiàn)表達(dá)，經(jīng)組織基質(zhì)到達(dá)血管，影響腫瘤患者病情[27-30]。本結(jié)果提示，CTC陽(yáng)性表達(dá)者的新輔助治療總緩解率、隨訪18個(gè)月的總生存率均低于陰性表達(dá)者，表明直腸癌患者的療效、預(yù)后與CTC表達(dá)有關(guān)。究其原因，CTC實(shí)際上是腫瘤細(xì)胞的一種統(tǒng)稱，多數(shù)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)機(jī)體免疫系統(tǒng)吞噬，而少量細(xì)胞逃逸，并在其他臟器部位定植，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，促使轉(zhuǎn)移病灶形成，影響療效與預(yù)后[31-33]。本研究繪制了ROC曲線，進(jìn)一步證實(shí)CTC計(jì)數(shù)對(duì)直腸癌患者的療效、預(yù)后有較高評(píng)估價(jià)值。CTC作為腫瘤細(xì)胞，可以通過(guò)原發(fā)灶釋放入血，或在摩擦破潰、受到物理擠壓后參與血液循環(huán)，例如直腸癌患者則可能因糞便摩擦破潰致CTC釋放入血，此外，人為手術(shù)牽拉也可致其釋放入血，導(dǎo)致CTC在外周血中表達(dá)增高，促進(jìn)癌細(xì)胞播散，增加復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后欠佳[34-36]。于軍輝等[37]也證實(shí)CTC對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后有預(yù)測(cè)價(jià)值，但其僅針對(duì)Ⅱ期患者進(jìn)行研究，而本研究納入了Ⅰ～Ⅲ期患者，較其研究更為嚴(yán)謹(jǐn)，參考價(jià)值更高。通過(guò)分析證實(shí)，臨床分期、分化程度及CTC表達(dá)是直腸癌患者預(yù)后的影響因素。CTC主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤病灶轉(zhuǎn)移，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[38]。而臨床分期越高、分化程度越低的患者治療難度大，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，也是影響預(yù)后的重要因素，臨床需引起重視，在直腸癌治療過(guò)程中綜合考慮上述多項(xiàng)因素，給予針對(duì)性干預(yù)。

綜上所述，直腸癌患者的CTC陽(yáng)性率較高，患者新輔助放療、化療的療效及預(yù)后與CTC表達(dá)密切相關(guān)，臨床可通過(guò)檢測(cè)CTC表達(dá)情況，對(duì)患者療效、預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究局限性在于僅選取了136例患者進(jìn)行研究，尤其在分組后各組樣本較少，且收集到的臨床病理特征條目較少，未來(lái)還需增加樣本量，進(jìn)一步完善臨床病理資料的收集，更加深入分析直腸癌患者CTC的臨床檢測(cè)價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

韋斌：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫、修改；鐘曉剛、麥威：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理；黃順榮：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；牙韓清、王曉通：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析