誘變結合小孢子培養的氮高效大麥DH株系評價

高潤紅，徐紅衛，郭桂梅，宗營杰，李穎波，杜志釗，陳志偉，陸瑞菊，王亦菲，劉成洪

(1.上海市農業科學院生物技術研究所, 上海 201106; 2.上海市農業遺傳育種重點實驗室, 上海 201106;3.上海市農業科技服務中心，上海200335)

氮素是作物生長所必需的元素之一，近幾十年農業生產力的提高與氮肥使用量大幅增加有關[1]。由于谷類作物的氮效率比較低，只有33%的肥料氮在谷物中得到利用[2]。過量的氮肥施用會導致資源的巨大浪費以及潛在的主要污染物[3]，因此，提高作物氮效率是作物改良的主要 目標。

大麥作為世界上第四大谷類作物，主要用于動物飼料和啤酒釀造。到目前為止，大麥育種主要集中在提高籽粒產量和品質上，與此同時氮效率也得到了提高，而且氮效率的兩個組成部分氮素吸收效率和氮素利用效率在基因型間也存在顯著差異[4]。但是由于集約化的育種和栽培導致大麥的遺傳多樣性變窄，成為遺傳改良的瓶頸[5]，因此，創制和篩選氮高效突變體的種質資源成為氮高效育種的一種有效的方法。

單倍體和加倍單倍體是加速植物育種的一種特別有吸引力的生物技術方法。單倍體技術通過配子胚胎發生，使雜合子親本一步培育出完整的純合品系，已經對許多農作物產生了重要的影響[6]。加倍單倍體在單倍體誘導后的第一個世代就能達到100%的純合率，不僅加速育種進程，而且從單倍體中獲得目的基因型(包括突變體)所需要的群體規模較小，同時也可以用于發現隱性、顯性以及有害性突變等[7]。單倍體誘導系統為突變體的誘導和選擇提供了一個理想的靶位點[6]。小孢子培養技術是產生單倍體的主要手段，通過誘變并與小孢子培養相結合可以在第一代中篩選隱性突變體，避免嵌合體；通過加倍能夠獲得純合穩定的突變體，縮短純合突變體產生的周期[8]，而且在一個培養體系里可同時實現突變體的誘變、篩選和純合穩定[9]。誘變結合小孢子低氮脅迫培養獲得低氮高效突變體材料已經在前期的工作中得到驗證[10]，獲得的低氮高效突變體材料氮效率的提高均是由于氮素吸收效率提高所導致[11-12]，還未篩選到氮素利用效率提高的突變體材料。

本實驗室利用誘變并結合小孢子低氮脅迫培養創制了一批DH株系，經過連續多年的田間肥力水平鑒定，獲得表現優異的突變體材料。本研究以花30不同誘變來源的8份DH株系為研究對象，在兩個氮肥水平下，以產量為標準將其劃分為不同的氮效率類型，同時對雙高效類型和低氮高效類型的株系進行干物質和氮素積累、轉運特征以及氮效率相關指標分析，以期為大麥氮高效篩選評價機制提供依據，并為氮高效品種的選育奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種花30以及花30不同組織(小孢子、種子和離體穗)經過化學或者物理誘變并結合小孢子低氮脅迫培養獲得的8份DH株系，分別為A1-184、A1-226、A9-41、A9-47、A4-17、A4-21、A5-24和A11-15。其中A1-184和A1-226是離體小孢子經過3 mg·L-1的甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfone, EMS)誘變后低氮脅迫培養獲得；A9-47和A9-41是離體小孢子經過5 mg·L-1的EMS誘變后低氮脅迫培養獲得；A4-17和A4-21是干種子經過400 GY的鈷60(60Co)輻照后田間種植，取游離小孢子低氮脅迫培養獲得；A5-24是干種子經過500 GY的60Co輻照后田間種植，取游離小孢子低氮脅迫培養獲得；A11-15是離體穗經過5 GY的60Co輻照后，取游離小孢子低氮脅迫培養獲得。材料創制方法詳情見陸瑞菊等[13]的 方法。

1.2 田間試驗設計

試驗于2018-2019年在上海市農業科學院重固試驗基地進行。大田試驗采取裂區設計，氮肥水平為主因素，株系為副因素，3次重復，小區行長3.3 m，行距0.33 m，每個材料種5行，每行180粒種子。基本苗為150萬株·hm-2。施肥水平為45 kg·hm-2純氮(低氮)和160 kg·hm-2純氮(高氮)。低氮只施入基肥，高氮施入基肥和追肥，基肥與追肥分配比例是3∶7，以氮磷鉀復合肥(各占15%)作為基肥在播種之前均勻施入，尿素(含N 46%)作為追肥，在分蘗期和拔節期分1∶1施入。其他措施按照一般田間管理方式進行。

1.3 樣品采集與測定

于開花期與成熟期，每個小區隨機選取5株生長表現一致的單株，分穗子和營養器官收獲，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，稱干重并記錄。粉碎后精確稱取0.100 0 g，濃硫酸消煮后定容至100 mL，取5 mL利用連續流動分析儀進行氮素含量測定。

1.4 計算方法

干物質積累量、氮素積累量、花前干物質轉運量(花后干物質積累量)對籽粒產量的貢獻率和花前氮素轉運量(花后氮素積累量)對籽粒氮素含量的貢獻率的計算參考熊淑萍等[14]的方法；氮效率、氮素吸收效率以及氮素利用效率的計算參考Moll等[15]的方法。

1.5 數據分析

數據用Excel進行整理，并利用DPS 7.05軟件進行顯著性分析(LSD法)。

2 結果與分析

2.1 田間氮高效株系的篩選

為了篩選氮高效株系，以產量性狀為指標，分別在高氮和低氮水平下進行比較分析。從表1可以看出，以親本花30作為對照，在高氮水平下有2份DH株系(A9-47和A1-184)的產量顯著高于花30；低氮水平下有3份DH株系(A5-24、A4-17和A9-47)的產量顯著高于花30。在田間施氮量降低70%的情況下，產量也明顯下降；與高氮水平相比，低氮水平下大多數株系包括親本花30的產量均下降了60%以上，其中，A9-41和A1-226的降幅達到了70%以上，說明這兩份株系對氮肥比較敏感；在這些株系中只有A5-24和A4-17的產量下降的幅度在60%以下，說明這兩份材料的耐低氮性要比其他株系好。

表1 花30和不同DH株系在兩個氮肥水平下的產量表現Table 1 Different yield performance of Hua 30 and the DH lines under two nitrogen fertilizer levels

Ⅰ：雙高效型；Ⅱ：低氮高效型；Ⅲ：雙低效型；Ⅳ：高氮高效型。H30：花30；HN：高氮；LN：低氮。

為了明確不同DH株系對氮肥的響應，以高氮和低氮水平下的平均產量為基準，將包括花30在內的9份株系分為4個不同的區。從圖1可以看出，A9-47和A1-184為雙高效類型，這2個DH株系在高氮和低氮水平下產量都高于供試株系的平均產量；A4-17和A5-24為低氮高效類型，這2個DH株系在低氮水平下產量高于供試株系的平均產量；A11-15、A4-21和花30歸為雙低效類型，這3個株系在高氮和低氮水平下產量均低于供試株系的平均產量；A1-226和A9-41歸于高氮高效類型，這2個株系只有在高氮水平下產量才高于供試株系的平均產量。

2.2 不同氮肥水平下雙高效和低氮高效類型株系與親本花30開花期和成熟期的干物質和氮素積累以及轉運特征

基于環境友好型考慮，分析了雙高效和低氮高效類型中4份材料的干物質和氮素積累特征(表2)。高氮水平下，開花期和成熟期A9-47和A1-184的干物質積累量以及A9-47的氮素積累量均顯著高于親本花30。低氮水平下，開花期A9-47和A1-184的干物質積累量和氮素積累量均顯著高于親本花30，成熟期四份株系的干物質積累量均顯著高于親本花30，其中A5-24和A9-47的氮素積累量也顯著高于親本花30。說明氮高效株系具有較高的干物質和氮素積累能力。

對花前干物質轉運量(花后干物質積累量)對籽粒產量的貢獻以及花前氮素轉運量(花后氮素積累量)對籽粒氮素含量的貢獻進行分析。結果(表3)表明，無論高氮還是低氮水平，花后干物質積累量對籽粒產量占主要貢獻，而高氮水平下花前氮素轉運量對籽粒氮素的含量占主要貢獻，低氮水平下花后氮素積累量占主要貢獻。對于不同株系而言，高氮水平下，A5-24和A9-47的花前干物質轉運量對籽粒產量的貢獻率顯著高于花30，而花30的花后干物質積累量對籽粒產量的貢獻率最高，顯著高于A5-24和A9-47，與其他株系之間差異不顯著；A5-24和A1-184的花前氮素轉運量對籽粒氮素的貢獻率顯著高于A4-17，和親本花30和A9-47之間差異不顯著，而A4-17的花后氮素積累量對籽粒氮素的貢獻率顯著高于A5-24，與親本花30、A9-47和A1-184之間差異不顯著。低氮水平下，A1-184的花前干物質轉運量對籽粒產量的貢獻率最大，其次是花30和A9-47，三者之間差異不顯著，A1-184的花前干物質轉運量對籽粒產量的貢獻率顯著高于A5-24和A4-17，而A4-17的花后干物質積累量對籽粒產量的貢獻率顯著高于A1-184，與其他株系之間差異不顯著；A1-184的花前氮素轉運量對籽粒氮素的貢獻率最大，其次是花30，兩者之間差異不顯著，而A1-184的花前氮素轉運量對籽粒氮素的貢獻率顯著高于A9-47、A5-24和A4-17，且花30的花前氮素轉運量對籽粒氮素的貢獻率顯著高于A4-17，而A4-17的花后氮素積累量對籽粒氮素的貢獻率顯著高于花30和A1-184，且A5-24、A4-17和A9-47的花后氮素積累量對籽粒氮素的貢獻率均顯著高于A1-184。說明同一類型株系之間的花前干物質(氮素)轉運量和花后干物質(氮素)積累量對籽粒產量(氮素)的貢獻也可能存在顯著的差異，推測同一類型株系之間也可能存在不同的氮素吸收利用機制。

表3 花30與不同DH株系干物質和氮素轉運特征Table 3 Characteristics of dry matter and nitrogen transportations between Hua 30 and DH lines

2.3 不同氮肥水平下雙高效和低氮高效類型株系的氮素吸收利用效率分析

從表4可以看出，高氮水平下，A9-47和A1-184的氮效率與親本花30相比，分別提高了 19.54%和19.68%，均顯著高于親本花30；A9-47的氮素吸收效率顯著高于親本花30，是花30的1.5倍；A1-184的氮素利用效率顯著高于親本花30，增幅14.53%。低氮水平下，A5-24和A9-47的氮效率和氮素吸收效率均顯著高于親本花30，增幅在20%以上，而A4-17的氮素利用效率略高于親本花30，但差異不顯著。說明在高氮水平下，A9-47氮效率的提高主要是由于氮素吸收效率的提高所導致，而A1-184氮效率的提高主要是由于氮素利用效率的提高所導致；在低氮水平下，A9-47和A5-24氮效率的提高主要是由于氮素吸收效率的提高所導致，A4-17具有相對較高的氮素利用效率，但氮效率與親本花30差異不顯著。值得注意的是，低氮水平能夠提高氮效率和氮素利用效率，表明低氮處理下較高的氮素同化能力能夠促使氮效率提高并促進產量增加。

表4 花30與不同DH株系在兩個氮肥水平下的氮素吸收利用情況Table 4 Difference of nitrogen use efficiency, nitrogen uptake efficiency and nitrogen utilization efficiency among Hua 30 and DH lines under two nitrogen fertilizer levels

3 討 論

3.1 關于氮效率類型的劃分

氮素在農業和食物系統中的行為與資源、環境、食物安全和人體健康等密切相關，是反映農業綠色發展的關鍵指標[16]，氮高效種質資源的創制和新品種培育是發展綠色農業的一個重要途徑。氮效率被定義為單位面積土壤供氮量所產生的作物籽粒產量，在同一個供氮水平下，多以籽粒產量作為氮效率評價的標準[17-18]。本研究在兩個氮肥水平下根據籽粒平均產量將花30及8份DH株系劃分為雙高效、低氮高效、高氮高效和雙低效四種類型。花30作為親本被劃分為雙低效型，A1-184和A9-47被劃分為雙高效型，其在高氮和低氮下均能夠獲得較高的籽粒產量，這兩個株系在實際生產中具有較大的應用潛力。A5-24和A4-17被劃分為低氮高效型，這兩個株系在低氮脅迫下能更好的吸收和利用氮素，可能存在氮高效吸收利用的分子機制。

目前，世界各地大多數品種測試系統都使用相對較高的氮素供應，育種者選擇的都是在這種水平下表現較好的品種，但是由于基因型和供氮量的互作，高氮水平下選擇的高產品種在低氮水平下表現并不一定優異[19]，因此，為了可靠地確定哪些品種在低氮水平下產量較高，需要在低氮水平下進行育種和測試[20]。Gouis等[21]證實了低氮水平下籽粒產量存在遺傳變異，基因型和氮素互作顯著；徐 晴等[17]認為，低氮處理更容易顯示出不同種質在氮素利用相關性狀上的差異；黃 億等[22]認為，氮高效基因型大麥在各個生育期的物質生產和氮素積累能力強，而且低氮處理下優勢較為明顯；Brancourt-Hulmel等[20]已經證明，小麥在低氮水平下進行直接選擇會更有效。本研究中A5-24和A4-17在低氮水平下的優異表現也證明了這一點，說明進行低氮脅迫篩選有必要且有用。

3.2 關于開花前后干物質和氮素積累量對籽粒產量的影響

植物在營養生長期，根系和葉片起到儲存器官的作用，吸收無機氮用于氨基酸和蛋白質的合成；在轉運期，植物根系和葉片將營養器官中儲存的氮素轉移到生殖器官[23-24]。有研究表明，大多數氮素在開花期之前積累在營養器官中，而在花后吸收的氮素很少，籽粒中的氮素積累主要依賴于營養器官的氮素供應[25-26]。本研究中，在氮素充足的條件下，同一個株系開花期和成熟期的氮素積累量之間差異較小，說明籽粒中積累的氮素在開花前就已經積累在營養器官中，而且花前氮素轉運量對籽粒氮素的貢獻率大于花后氮素積累量，也證明了這一觀點。而在低氮脅迫條件下，花前干物質轉運量對籽粒產量的貢獻率和花前氮素轉運量對籽粒氮素貢獻率都比較小，可能是由于缺氮導致光合作用受阻，抑制營養體的生長，使籽粒干重和氮素含量主要來源于花后干物質和氮素的積累。

作物干物質生產和氮素積累特性與產量和氮效率關系密切[22]。徐 晴等[17]認為，氮素高效小麥應具有較高的形成生物學產量和積累氮素的能力；李淑文等[27]表明，氮脅迫條件下小麥生育中后期較強的氮素吸收能力是氮高效品種在缺氮條件下籽粒產量和氮效率提高的重要生理基礎；Worku等[28]研究表明，低氮條件下熱帶玉米雜交種的高產與后期較高的氮素吸收量、單位氮素積累量和氮素收獲指數密切相關。葉利庭等[29]認為，齊穗后氮高效水稻具有較強的氮素吸收或轉運能力才能滿足植株對氮素的利用。在本研究中，對于雙高效型株系A9-47和A1-184而言，不管是高氮水平還是低氮水平，開花期和成熟期的干物質和氮素積累量均高于或者顯著高于親本花30；低氮水平下，A5-24和A4-17在成熟期的干物質和氮素積累量均高于或者顯著高于親本花30，這種較高的干物質和氮素積累能力為籽粒產量的提高奠定生理基礎，同時也可以作為氮高效種質材料篩選的基礎指標。

3.3 關于氮素高效吸收(NUpE)與氮素高效利用(NUtE)材料的獲得

氮效率可以被分為氮素吸收效率和氮素利用效率兩部分，這兩個部分哪個更重要尚無統一報道。在玉米中有報道認為，在高氮水平下，氮效率的變化可以用氮素吸收能力的變化來解釋，而在低氮水平下，氮效率的變化主要是由于氮素利用效率的不同導致的[15,30]；劉 鵬等[31]認為，高粱在高氮處理水平下，氮素吸收效率和氮素利用效率對氮效率貢獻相同，而在低氮處理水平下，氮素利用效率對氮效率貢獻大于氮素吸收效率；張亞麗等[18]認為，吸氮量和氮素利用效率對產量的貢獻率受到水稻生育期的影響，對于生育期較短的水稻，無論供氮水平高低，均是氮素利用效率對產量起決定作用；而生育期較長的水稻，低氮水平下是氮生理利用效率起決定作用，高氮水平下是氮吸收量起決定作用；Worku等[28]研究表明，低氮水平下玉米的氮素吸收效率和氮素利用效率對氮效率有同等貢獻；在前期工作中我們篩選到了氮高效大麥種質材料，不管是高氮還是低氮水平，氮效率的提高均是由氮素吸收效率提高導致的[11-12]，而在本研究中不僅篩選到了氮素吸收效率提高的DH株系A9-47和A5-24，而且也篩選到了氮素利用效率提高的DH株系A1-184和A4-17。高氮水平下，A1-184的氮素吸收效率和親本花30沒有顯著差異，但是氮素利用效率的顯著提高導致了氮效率的提高；而低氮水平下，A4-17的氮素利用效率也略高于親本花30，從而促使產量的 提高。