Cre-loxP 基因敲除技術(shù)在膝骨關(guān)節(jié)炎研究中的最新進展

何峰，趙興昌，梁清洋，謝克恭，唐毓金，劉佳★

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色；2.安徽省明光市人民醫(yī)院 骨科，安徽 明光；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色）

0 引言

Cre-loxP[1]系統(tǒng)是一種條件性基因敲除（Conditional Knockout,CKO）技術(shù)，Cre 表示一種特異性位點重組酶，loxP就是一小段DNA 序列，大約長34 bp。Cre 重組酶能介導(dǎo)兩個34 bp 的loxP 之間的位點特異性重組，使loxP 位點間的序列位點或基因被刪除。CKO 與全身性基因敲除（Knockout,KO）法不同，靶基因只局限在某一特定的細胞、組織、器官或生長的某一特定階段，這種技術(shù)最大優(yōu)勢就是具有時空可控性和組織特異性[2]。經(jīng)過十多年的快速發(fā)展，這項技術(shù)已經(jīng)可以方便地為我們實現(xiàn)對小鼠特定發(fā)育階段或特定組織中的靶基因隨意編輯了。最近幾年，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Cre-loxP 基因敲除技術(shù)造模研究膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis,KOA）[3]明顯增加。隨著社會老齡化，KOA 的病人越來越多，至2020 年已經(jīng)成為導(dǎo)致老年人慢性殘疾的第四大罪魁禍首。KOA 對人類膝關(guān)節(jié)威脅之大已成為廣大骨科醫(yī)生的共識，它屬于隨年齡增長緩慢退變性疾病。當前經(jīng)過調(diào)查國內(nèi)外大量相關(guān)文獻，綜合表明KOA 的發(fā)生是一個長期復(fù)雜的過程，其最終共同的病理特點主要是膝關(guān)節(jié)的軟骨及軟骨下骨組織無菌性炎癥反應(yīng)、軟骨細胞凋亡破壞和軟骨細胞外基質(zhì)的不斷丟失伴有骨贅增生。運用新發(fā)現(xiàn)的基因做CKO 小鼠模型對于KOA 信號通路的研究有著重要意義[4]，也是Cre-loxP 基因敲除技術(shù)在KOA 的研究上有著無可比擬的優(yōu)勢所在，同時也拓展了我們對于KOA 的干預(yù)思路。近年來Cre-loxP 基因敲除技術(shù)發(fā)展日趨成熟，對生物體內(nèi)的靶點進行基因敲除有助于更清楚地研究其功能，對臨床治療同樣意義非凡。

1 Cre-loxP 基因編輯技術(shù)

1.1 Cre-loxP 發(fā)展歷程

在上世紀80 年代，科學(xué)家們首次成功分離并在體外培養(yǎng)出了胚胎干細胞，Thompsson 等人在分子水平上利用相同來源的基因片段重新互補組合，即為基因敲除技術(shù)的核心所在。利用新產(chǎn)生的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)功能截然不同，某些片段的功能可能丟失的特點，設(shè)計出了基因敲除小鼠模型。2007年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎[5]授予了在基因修飾和老鼠胚胎干細胞技術(shù)研究領(lǐng)域取得重大突破的三位科學(xué)家，他們的研究成果就是發(fā)現(xiàn)了特殊的基因修飾技術(shù)和鼠胚胎干細胞分離技術(shù)，之后在這項技術(shù)上創(chuàng)造出了“基因敲除”。初期的基因敲除技術(shù)也就說通常所說的全身基因敲除（KO），后來經(jīng)過技術(shù)改進逐漸發(fā)展為CKO。目前實際應(yīng)用比較多的是Cre-Loxp 技術(shù)和CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR）[6]/Cas9（相關(guān)蛋白核酸酶9）（CRISPR associated nuclease 9,Cas 9）技術(shù)[7]，還有最新的ZFN 和TAILEN 技術(shù)。

1.2 Cre-loxP 系統(tǒng)作用機制

首先經(jīng)由基因打靶技術(shù)在基因組的靶位點上插入兩個同向排列的1oxP 短片段基因，此時的靶基因尚未達到被敲除的目的，相關(guān)小鼠的表型仍同野生型一樣。Cre 基因的特點是能夠表達一種特別重要的酶叫做Cre 重組酶，編輯了不同Cre 重組酶的各種組織特異性的小鼠就是Cre 轉(zhuǎn)基因工具鼠，它的重要作用就是產(chǎn)生類似剪刀的切除功能，它能特異性識別1oxP 系列，在loxP 指引下能準確切除目標基因兩端同向1oxP 區(qū)間內(nèi)的一整段基因片段，還能使敲除后的片段環(huán)化，余下的兩條鏈重新連接；最后將設(shè)計好的“l(fā)oxP-floxed”小鼠與Cre 轉(zhuǎn)基因工具鼠雜交，雜交后產(chǎn)生的子代小鼠中將有一部分體內(nèi)同時攜帶“l(fā)oxP-floxed”靶基因和Cre 基因，它就是CKO 小鼠模型。在這個過程中，正是Cre 基因為我們達到了在特定組織或器官敲除靶基因的目的，因為只要把Cre 重組酶的編碼序列置于某種特定基因啟動子下，它就能在特定的目標組織或器官中表達，凡是表達了Cre 的細胞，兩個同向排列的1oxP 間的靶基因都會被切除，這樣就實現(xiàn)了靶基因在何時何地發(fā)生敲除的可控性。Cre-loxP 系統(tǒng)作用機制[8]見圖1。

圖1 Cre-loxP 系統(tǒng)作用機制簡圖

1.3 Cre-loxP 與其他基因編輯技術(shù)的比較

Cre-loxP CKO 較其他基因敲除技術(shù)的優(yōu)勢之處在于可以運用一種靶基因編輯的“l(fā)oxP-floxed”小鼠與不同Cre 工具鼠搭配，達到靈活運用研究靶基因在不同組織器官中的發(fā)生機制和影響，還能避免重要靶基因被敲除后小鼠的過早死亡現(xiàn)象。

基因誘捕技術(shù)是在小鼠基因敲除相關(guān)研究領(lǐng)域中又一重大發(fā)現(xiàn)。原理是通過一定的技術(shù)手段先隨機破壞靶基因，那么其對應(yīng)的功能也就喪失了，從而實現(xiàn)大規(guī)模基因敲除策略。運用這項技術(shù)不但節(jié)約成本而且快速有效[9]；但也有很多弊端，如在基因誘捕過程中發(fā)生載體的部分片段丟失；還有可能隨機發(fā)生一大段基因的誤刪除等情況。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)有多點編輯效率高、可操縱性強等優(yōu)勢，但存在脫靶、錯配的情況，只有進一步提高安全性和降低操作成本才能被廣泛應(yīng)用。

雖然目前Cre-loxP CKO 技術(shù)被應(yīng)用較多，但也存在諸多尚待解決的問題如小鼠的擴繁過程繁瑣；Flox 純合并且Cre雜合的小鼠模型獲得周期太長；得到批量模型動物付出的成本較高；Cre 重組酶在體內(nèi)造成嚴重的細胞毒作用等。

總之，Cre-loxP CKO 基因敲除技術(shù)為我們研究探索靶基因在體內(nèi)的功能打開了另一扇門，利用Cre-loxP 系統(tǒng)來生產(chǎn)特定基因敲除小鼠仍是目前一種強大且已成熟的策略。

2 膝骨關(guān)節(jié)炎

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）對人類膝關(guān)節(jié)威脅之大已為廣大骨科醫(yī)生所認同，國際骨科大會曾多次討論過該課題。KOA 最常發(fā)生于中老年人群，呈現(xiàn)病程長、進展慢的特點，晚期對膝關(guān)節(jié)破壞嚴重。病理特征為軟骨細胞被持續(xù)破壞而數(shù)量減少，軟骨下骨暴露且硬化重建。至2020 年已經(jīng)成為導(dǎo)致老年人慢性殘疾的第四大罪魁禍首。當前經(jīng)過調(diào)查國內(nèi)外大量相關(guān)文獻，綜合表明KOA 的發(fā)生是一個復(fù)雜的長期綜合作用導(dǎo)致的結(jié)果，是多因素疊加后相互影響所致的疾病，但是進展是緩慢且漸進的，其最終共同的病理特點主要都是無菌性炎癥反應(yīng)、軟骨細胞凋亡破壞和軟骨細胞外基質(zhì)的不斷丟失伴有骨贅增生。其中基質(zhì)是指關(guān)節(jié)軟骨細胞之外的部分，它的減少是占據(jù)主導(dǎo)地位的，因為軟骨細胞外基質(zhì)直接營養(yǎng)軟骨細胞，它發(fā)生了分解代謝，則軟骨細胞生存困難，于是軟骨降解而最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎。

3 Cre-loxP 技術(shù)在KOA 相關(guān)基因研究中的應(yīng)用

探索KOA 相關(guān)基因的致病機制已成為當前研究的熱點，近5 年來關(guān)于利用CKO 小鼠來作為KOA 研究模型的文獻數(shù)量呈逐年上漲的趨勢。在PUBMED 對2015年1月1日至2020年6月30日的文獻以關(guān)鍵詞mouse/mice 和osteoarthritis/OA 檢索，有40 篇用到基因敲除小鼠，排除了8篇不完全相關(guān)文獻，余下的24 篇[相關(guān)基因：TNFα、GRK5、Smo、HTRA1、microRNA-485-5p、Elf3、IkappaBzeta、Fyn、ERRγ、CCL2/CCR2、Crtac1、HSPG-2、Dio2、BATF、TCF7L2、JNK-2、BMAL1、HSP70、TRPA1、Notch、Bach1、Drosha、ECS、（HIF）-2a] 是關(guān)于研究誘導(dǎo)型KOA 基因的，8 篇（相關(guān)基因：Sost、FGFR3、IL-4、Enpp1、A2AR、Matn1、MTs、DUSP1）是關(guān)于研究預(yù)防型KOA 基因的。

這些新篩選的基因是目前骨性關(guān)節(jié)炎研究領(lǐng)域的熱點，系統(tǒng)歸類最新發(fā)現(xiàn)的CKO 基因?qū)τ谶M一步研究它們在KOA中的作用機制是必要的。本文中基因符號的單詞書寫形式因為沒有統(tǒng)一標準，所以只能根據(jù)它的來源文獻確定，故而這些符號與官方文書中的寫法可能有所不同，所有統(tǒng)計的文獻中關(guān)于CKO 基因的研究效果評價都是建立在與野生型小鼠的效果對照比較而得出的結(jié)論，具有客觀性。但是其真實效果還應(yīng)該得到進一步擴大認證才可最終確定，這樣才更具有科學(xué)的說服力。但是，經(jīng)過仔細研究文獻發(fā)現(xiàn)其中部分文獻對于Sost 這個基因的功能研究還存在爭議。Veronesi F 等人[10]研究后得出這樣一個結(jié)論，認為對KOA 無影響基因中就包括Sost 基因。而Li J 等人[11]卻在自己的研究結(jié)論中闡明Sost 是KOA 的一個保護型基因。為了解決這一爭議問題還需更深入地開展研究以證實其確切功能。

4 Cre-loxP 技術(shù)在KOA 領(lǐng)域的應(yīng)用前景

4.1 信號通路的研究

Cre-loxP 技術(shù)在動物體內(nèi)水平研究基因功能是一種高效的方法，而且也是研究目的基因表達變化和調(diào)控機制信號通路的有效手段。近些年來世界許多骨科重點實驗室都在基因?qū)用鎳L試研究KOA 相關(guān)的基因及其信號傳導(dǎo)通路，已通過此項技術(shù)發(fā)現(xiàn)了較多影響KOA 的信號通路。如Wnt/β-catenin、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target Of Rapamycin,mTORC）信號通路等。如果在對這些重要信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)可以解決KOA 治療的靶點，對臨床來說意義重大。

4.2 KOA 動物模型的建立

我們知道KOA 是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，想要更好地研究KOA 發(fā)病機制及防治辦法，前提條件是建立接近自然病理狀態(tài)的動物KOA 模型，這樣才能獲得對病理機制和臨床治療研究的更為準確的結(jié)果。目前國際KOA 研究領(lǐng)域構(gòu)建的實驗動物模型主要是Cre-loxP 條件基因敲除小鼠，它與經(jīng)典的動物模型相比有明顯的優(yōu)勢，如對于KOA 研究除了這種模型小鼠在基因修飾方面無可比擬的優(yōu)勢以外，小鼠的遺傳背景清晰、混雜因素少、疾病可復(fù)制性好、總體可控及操作相對簡單等好處都是顯而易見。但是，目前購買轉(zhuǎn)基因動物的價格昂貴，飼養(yǎng)時對環(huán)境及飲食要求高，成本增加。而且建立較大體型的轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)尚未突破，目前小鼠因體積較小造成手術(shù)操作難度加大、以及基因檢測鑒定程序繁瑣過程復(fù)雜等，這些無疑都限制了它的廣泛應(yīng)用。相信隨著對Cre-loxP 技術(shù)更深入地研究，KOA 模型動物的培育技術(shù)會不斷改進，成本也會逐漸下降，操作過程也會更加簡單方便，相信這項技術(shù)一定會為KOA 的深入研究做出更大貢獻。