循環腫瘤DNA與結直腸癌RAS、BRAF基因突變的相關性

陳飛 程祺 姜峰 隋殿晶

(吉林省腫瘤醫院內四科，吉林 長春 130012)

結直腸癌是全球常見高度惡性腫瘤之一，其發病率現已居第3位，腫瘤相關性死亡由于結直腸癌引發的已占9%左右〔1〕。近年來，隨著對腫瘤的研究不斷深入，基因檢測和靶向藥物治療已成為熱門領域，同時也對結直腸癌患者的生存起到了一定改善作用〔2〕。目前對于結直腸癌的研究中RAS通路已趨于成熟，其中KRAS/BRAF/NRAS基因是常用檢測位點，且突變提示表皮生長因子受體(EGFR)單抗類藥物耐藥，故國內外各指南均推薦結直腸癌患者進行RAS通路的位點檢測〔3，4〕。目前實際工作中對于基因的檢查僅通過活體腫瘤組織進行，但組織活檢存在其自身的局限性，且無法克服腫瘤組織中存在的空間及時間異質性〔5〕。循環腫瘤DNA(ctDNA)主要指腫瘤細胞已釋放進入血液循環中的DNA片段，被認為包含有腫瘤組織的完整基因信息。ctDNA最大的優勢在于簡便、微創及動態檢測，目前已成為基因檢測最熱門的樣本。既往諸多研究顯示〔6，7〕，ctDNA的檢測能夠對結直腸癌的預后及療效進行預測，但ctDNA與活體組織標本所測DNA之間的差異研究較少，本研究旨在探討ctDNA與組織標本DNA所測基因突變的一致性及其相關因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取吉林省腫瘤醫院2019年1月至2020年12月收治的轉移性結直腸癌患者61例。年齡30～78歲，中位年齡58歲；男38例，女23例；原發病部位左半結腸26例(42.6%)，右半結腸16例(26.2%)，直腸19例(31.1%)；轉移數：<2個34例(55.7%)，≥2個27例(44.3%)；肝轉移42例(68.9%)，無肝轉移19例(31.1%)；肺轉移27例(44.3%)，無肺轉移34例(55.7%)；盆腔轉移13例(21.3%)，無盆腔轉移48例(78.7%)；遠處淋巴結轉移11例(18.0%)，無遠處淋巴結轉移50例(82.0%)。納入標準：(1)年齡≥30 歲；(2)病理組織學或細胞學確診為轉移性結直腸腺癌，影像學證實存在1個或多個轉移灶；(3)能夠提供腫瘤組織標本進行KRAS、NRAS、BRAF 基因檢測；(4)不伴有其他原發腫瘤。本次研究獲得醫院倫理委員會審核通過，所有患者及家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本的采集及處理 在開始治療前抽取患者外周靜脈血10 ml， 放入專用的含EDTA抗凝血劑和細胞防腐劑的BCT管中，輕輕倒轉8～10次，常溫下保存和運輸，2 h內進行離心處理。

1.2.2ctDNA的提取 參照DNA提取試劑盒說明書步驟進行提取，提取好的DNA樣本，使用Qubit3.0熒光計檢測其濃度，濃度在2 ng/μl以上為合格。

1.2.3RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因檢測 應用微滴式數字PCR(ddPCR)技術平臺進行ctDNA及腫瘤組織標本RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突變檢測，生成檢測報告。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行Kappa值符合率比較、χ2檢驗及多因素回歸分析。

2 結 果

2.1患者基因突變情況 61例患者腫瘤組織基因突變檢測結果：KRAS突變型患者26例(42.6%)，野生型35例(57.4%)；NRAS突變型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)BRAF突變型5例(8.2%)，野生型56例(91.8%)；61例患者血漿ctDNA基因突變結果：KRAS基因突變型患者21例(34.4%)，野生型40例(65.6%)；NRAS突變型3例(4.9%)，野生型58例(95.1%)；BRAF突變型患者4例(6.6%)，野生型57例(93.4%)。

2.2兩種方法結果一致性比較 KRAS：血漿ctDNA與組織檢測突變結果對比，KRAS突變型一致性為 85.2%(Kappa=0.831，P<0.05)，靈敏度 73.1%，特異性94.3%。NRAS：血漿ctDNA與組織檢測突變結果對比，NRAS突變型一致性為 93.4%(Kappa=0.769，P<0.05)，靈敏度40.0%，特異性98.2%。BRAF：血漿ctDNA與組織檢測突變結果對比,BRAF突變型一致性為 95.1%(Kappa=0.833，P<0.05)，靈敏度60.0%，特異性98.2%。

2.3影響一致性的因素分析 兩組方法在檢測基因位點突變時，一致率較高，單因素分析結果顯示，初診治療情況是影響一致性的因素(P<0.05)，見表1。將單因素分析具有統計學意義的因素進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，初診治療情況及肝轉移是影響兩種方法檢測一致性的因素，見表2。

表1 影響一致性的單因素分析〔n(%)〕

表2 多因素回歸分析

3 討 論

隨著腫瘤發病率的增加及對腫瘤研究的不斷深入，諸多研究已報道結直腸癌的發病與基因突變存在密切相關性〔8，9〕，基于基因檢測的腫瘤分子分型及個體化治療方案已成為轉移性結直腸癌的常規治療模式。結直腸癌基因檢測取材于腫瘤組織，組織獲取為有創性操作，在同一例患者無法反復多次進行。循環腫瘤DNA基因檢測是一項非侵入式檢測的“液體活檢”技術。本研究通過ddPCR法檢測了61例轉移性結直腸癌患者血漿ctDNA及腫瘤組織中RAS(KRAS、NRAS)、BRAF基因突變情況，結果與既往研究中的一致率接近(89%～93%)〔10〕。兩種方法對于突變基因檢測的結果仍存在一定不一致性，其受到多種因素的影響，首先兩種方法所選用的標本采集時間不完全相同，其次本研究患者在進行血漿ctDNA的檢測時已進行了相關抗腫瘤治療，會導致血漿中ctDNA濃度下降，最終使得結果存在一定偏倚。最后ctDNA對于基因突變的檢測靈敏度較高，也可能出現了活體組織中在低豐度未檢測出的位點在ctDNA檢測中呈現出陽性的情況〔11，12〕。另一方面，不同腫瘤組織間，原發灶及轉移灶不同轉移灶之間存在腫瘤異質性，也是導致兩種方法檢查結果不一致的原因之一。

本研究發現，存在組織基因野生且經過抗EGFR治療后，經ctDNA檢測KRAS、BRAF、NRAS發生突變，與既往報道結果相似〔13〕。結果進一步提升，在接受抗EGFR治療期間，通過對ctDNA的檢測能夠及時發現藥物的耐藥性，所有位點基因中最為常見的突變為KRAS突變。既往研究也發現〔14〕，經過動態的ctDNA連續性監測，能夠觀察到抗EGFR藥物治療后會誘發KRAS的突變，在停止治療后，突變的豐度也會隨之下降及消失，若再次恢復治療可獲得一定收益。故而對于ctDNA進行動態的連續性監測能夠更加準確地對靶向治療進行指導〔15，16〕。本研究發現肝轉移患者居多，且有半數以上患者伴有其他部位轉移，此部分患者則存在腫瘤負荷較高的情況，故而對于肝轉移患者的不同方法檢測，一致率較高。既往研究表明〔17〕，ctDNA的水平與相關腫瘤負荷存在密切相關性，當腫瘤負荷較低時，ctDNA出現假陰性的概率較高，兩種方法檢測結果的一致性也更低。

綜上，兩種方法對于結直腸癌患者基因突變檢測一致性較高，導致不一致的主要原因可能與既往診療情況有密切關系。本研究仍存在一定不足，首先本研究僅為單中心研究，納入樣本量較小；其次對于患者后續未進行相關隨訪，未能夠對兩種方法檢測不一致的患者進行預后追蹤。下一步仍需進行多中心及大樣本量的臨床研究。