乳腺癌細(xì)胞中骨膜蛋白的表達(dá)

何凡 阮劍 寧曉潔 王靜

(武漢市第一醫(yī)院 1甲乳外科，湖北 武漢 430022；2婦科)

骨膜蛋白(POSTN) 是一類由POSTN基因編碼的糖蛋白，是基質(zhì)細(xì)胞蛋白的一種〔1〕。POSTN參與多種生理和病理過程。生理情況下，POSTN在膠原纖維原形，傷口愈合等過程中起到重要作用〔2〕。同時(shí)POSTN在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中起到關(guān)鍵作用，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育的過程中是必不可少的〔3〕。POSTN還在骨骼和牙齒結(jié)構(gòu)的矯正〔4〕，心臟發(fā)育過程中起到一定作用〔5〕。近些年來，有不少的研究顯示，POSTN還在腫瘤的形成中起到一定作用，然而其具體作用的機(jī)制卻仍未被闡明。最開始的研究認(rèn)為，POSTN與表達(dá)在癌細(xì)胞膜表面的整合素受體結(jié)合，并通過加速癌細(xì)胞的血管生成和新陳代謝而加速其發(fā)展〔6～11〕。新的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和大腸癌中，POSTN能通過與整合素αvβ3 和 αvβ5相互作用，誘發(fā)蛋白激酶B(AKT/PKB)信號(hào)通路的活動(dòng)〔12，13〕。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)POSTN能夠增強(qiáng)在腫瘤干細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的活動(dòng)〔14〕。抑制乳腺癌細(xì)胞中POSTN與整合素的結(jié)合，能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的代謝水平和擴(kuò)散能力〔15〕。正是由于POSTN在多種腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，更多的研究熱點(diǎn)是希望將其作為腫瘤診斷的標(biāo)記物。在不同類型腫瘤患者中，癌細(xì)胞中高水平表達(dá)的POSTN往往與較差的預(yù)后相關(guān)。這些患者的生存周期顯著縮短，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯提高，癌癥復(fù)發(fā)的概率也會(huì)增加，同時(shí)還有更高程度的耐藥性出現(xiàn)〔16～19〕。相同的結(jié)果也在離體腫瘤細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)，即高表達(dá)POSTN的腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵略性與更強(qiáng)的代謝能力〔20，21〕。有研究表明22，POSTN的表達(dá)在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)與非浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管原位癌(DCIS)中是不同的，然而其具體關(guān)系仍有待探究。本研究比較不同類型離體乳腺癌細(xì)胞系中POSTN的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。其中MCF-7細(xì)胞系代表侵入性較弱的乳腺癌細(xì)胞，其表達(dá)雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)及原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)2。SK-BR-3與MCF-7細(xì)胞系的侵入性近似，表達(dá)PR與HER2，但是不表達(dá)ER。MDA-MB-231的侵入性最強(qiáng)，且不表達(dá)ER，PR與HER2。

1.2乳腺癌病理材料 收集2015年1月至2018年12月武漢市第一醫(yī)院病理科材料共計(jì)94例，其中DCIS材料44例，IDC材料50例，由高年資病理醫(yī)師復(fù)核組織切片，結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學(xué)資料。

1.3主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購自美國(guó)Gibic公司，實(shí)驗(yàn)中用到的抗體購自美國(guó)Abcam公司，RNA提取試劑盒RNeasy mini kit購于德國(guó)Hilden公司，反轉(zhuǎn)錄所需要的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國(guó)Applied Biosystems公司，免疫組化工具Autostainer Link 48購于丹麥Dako公司。

1.4方法

1.4.1RNA的分離 cDNA合成與實(shí)時(shí)定量PCR所有RNA均通過RNeasy mini kit提取。通過DM-2000測(cè)定提取的RNA的濃度和純度，并使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄POSTN mRNA引物由寶生物(大連)工程有限公司合成，選用β-actin作為內(nèi)參，序列：POSTN上游：GCCATAACATCGGACATA、下游：CTCCCATAATAGACTCAGAAC，退火溫度60℃；β-actin上游：ACACTGTGCCCATCTACGAGG、下游：AGGGGCCGGACTCGTCATACT，退火溫度60℃。POSTN的定量分析通過ΔΔCt 方法。

1.4.2Western印跡檢測(cè) 取各細(xì)胞系的細(xì)胞并用放射免疫沉淀粉析液(RIPA)裂解液提取蛋白分別標(biāo)記。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，去除蛋白并加入等體積的上樣緩沖液后煮沸5 min。將變形的蛋白溶液50 μg/孔等量上樣，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后用電轉(zhuǎn)膜儀將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脫脂奶粉中封閉，并加入以1∶200稀釋的兔源一抗過夜，Tris-Hcl緩沖鹽吐溫溶液(TBST)洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)進(jìn)行雜交，孵育1 h。洗膜后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色，并放入凝膠成像掃描儀下掃描，使用Image J進(jìn)行灰度值定量分析。

1.4.3免疫熒光 細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定12 min，并用PBST溶液孵育10 min。之后細(xì)胞中加入POSTN一抗，放入4℃過夜。之后使用二抗進(jìn)行熒光染色，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記細(xì)胞核位置。細(xì)胞封片后使用共聚焦激光顯微鏡拍攝。

1.4.4免疫組化 腫瘤標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，脫水并石蠟包埋。使用Autostainer Link 48進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。標(biāo)本脫蠟后使用Target Retrieval Solution溶液修復(fù)抗原。標(biāo)本使用兔源一抗室溫孵育20 min后繼續(xù)用二抗孵育20 min，并用DAB顯色。標(biāo)本用蘇木素復(fù)染，并用酒精干燥脫水，二甲苯透明，封片，用BX41光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同乳腺癌細(xì)胞系中POSTN mRNA表達(dá)的差異 對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN mRNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，MDA-MB-231細(xì)胞系的POSTN mRNA表達(dá)(16.21±1.82)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(10.12±0.48、2.32±0.24，均n=4，F(xiàn)=159.582，P=0.000)，SK-BR-3細(xì)胞系的POSTN mRNA表達(dá)明顯多于MCF-7(P<0.001)。

2.2不同乳腺癌細(xì)胞系中POSTN 蛋白質(zhì)表達(dá)的差異 對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN蛋白質(zhì)水平進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，MDA-MB-231細(xì)胞系的POSTN 蛋白表達(dá)(2.16±0.15)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(1.48±0.19、1.02±0.09，均n=4，F(xiàn)=59.178，P=0.000)，SK-BR-3細(xì)胞系的POSTN 蛋白表達(dá)明顯多于MCF-7(P<0.000 1)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)三種乳腺癌細(xì)胞系中POSTN的表達(dá)

2.3不同乳腺癌細(xì)胞系中POSTN 蛋白表達(dá)免疫熒光結(jié)果 對(duì)三種乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行POSTN蛋白染色發(fā)現(xiàn)結(jié)果與Western印跡結(jié)果類似，MDA-MB-231細(xì)胞系的POSTN 蛋白質(zhì)表達(dá)(21.35±2.65)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(15.36±2.11、9.25±0.56，均n=4，F(xiàn)=37.261，P=0.000)。見圖2。

圖2 POSTN蛋白在三種細(xì)胞系表達(dá)的熒光染色

2.4臨床DCIS與IDC病理標(biāo)本POSTN蛋白質(zhì)組化結(jié)果 對(duì)DCIS與IDC病理標(biāo)本進(jìn)行POSTN蛋白組化染色發(fā)現(xiàn)，IDC標(biāo)本中的POSTN(1.20±0.40，n=50)顯著多于DCIS(1.01±0.50，n=44；t=2.045，P=0.046)。

3 討 論

乳腺癌是中國(guó)女性最常見的癌癥之一，并且近年來乳腺癌發(fā)病率和死亡率也有明顯的上升趨勢(shì)。高侵襲性乳腺癌由于其易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，難以通過手術(shù)等常規(guī)方法根除，因此早發(fā)現(xiàn)早治療成了提高患者生存率的最有效方法，對(duì)于癌細(xì)胞的早期診斷技術(shù)也是目前研究的熱點(diǎn)。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，POSTN在乳腺癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞中都有高表達(dá)，且在30%～60%的其他類型癌癥細(xì)胞中也有異常表達(dá)〔22，23〕。然而POSTN蛋白表達(dá)水平與乳腺癌侵襲性的相互關(guān)系卻鮮有報(bào)道。

POSTN這類糖蛋白被認(rèn)為是大量表達(dá)于細(xì)胞外基質(zhì)，并參與多種生理和病理過程，然而新的研究通過Western印跡和免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常細(xì)胞，POSTN在癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中也有高表達(dá)〔24，25〕。同時(shí)POSTN的表達(dá)與癌癥細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)關(guān)系〔17〕。這提示我們胞內(nèi)POSTN的表達(dá)可以很好地作為檢測(cè)乳腺癌水平的診斷標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)在小鼠上的實(shí)驗(yàn)也證明高表達(dá)POSTN的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更大，腫瘤惡化概率更高〔25〕，證明了POSTN與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。同時(shí)我們臨床DCIS與IDC病理標(biāo)本也證明了，在侵襲性強(qiáng)的IDC乳腺癌標(biāo)本中，POSTN的表達(dá)顯著高于DCIS標(biāo)本。類似的臨床研究顯示，伴有淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的外泌體中，POSTN的含量顯著高于未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，并且POSTN高表達(dá)的患者的生存率低于POSTN低表達(dá)患者〔26〕。這些結(jié)果提示，POSTN的表達(dá)是與乳腺癌發(fā)展程度相關(guān)的，并且可以作為衡量其發(fā)展程度的生物學(xué)標(biāo)志。

綜上，POSTN在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)程度與乳腺癌細(xì)胞的侵襲性相關(guān)，高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中的POSTN表達(dá)含量明顯增多，并且離體細(xì)胞系的結(jié)果與臨床病理標(biāo)本的結(jié)果一致。但POSTN在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。