魚類白細胞介素-1β研究進展

李慶偉， 宋曉萌， 逄 越

(1.遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081；2.遼寧師范大學 七鰓鰻研究中心，遼寧 大連 116081)

白細胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)家族及其相應受體是介導炎癥反應的主要信號分子.IL-1家族成員是一類細胞因子，通過連接先天和后天免疫系統啟動炎癥級聯反應[1].在哺乳動物中已經發現了11個IL-1家族成員[2-3]，根據其共有序列，可分為3個亞家族：具有促炎活性的分子(IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36α, IL-36β和IL-36γ)、天然受體拮抗劑(IL-1Ra, IL-36Ra和IL-38)和抗炎細胞因子(IL-37)[4].

目前，在魚類中僅發現2個IL-1家族成員：IL-1β和IL-18[5].IL-1β作為一種有效的促炎細胞因子，在哺乳動物機體免疫調控中發揮著重要作用[6]，是IL-1家族中研究最多的成員.隨著對IL-1β研究的不斷深入，目前已克隆得到多種魚類的IL-1β基因，并利用多種生物學技術對魚類IL-1β的組織表達及功能展開研究.本文從IL-1β的進化、結構、在各組織中分布情況以及生物學功能等方面進行總結，以期為了解魚類IL-1β的結構和功能奠定理論基礎.

1 IL-1β的進化研究

IL-1β最初在人類(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)中被發現，目前的研究已經證實該分子不僅在哺乳動物中存在，還在雞(Gallusgallus)[7]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[8]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[9]等非哺乳動物中存在.1999年，Zou等人采用同源克隆的方法，最早從虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中克隆得到IL-1β基因序列[10].到目前為止，已在多種魚類中鑒定出了IL-1β基因，包括虹鱒、草魚(Ctenopharynogodoniddla)[11]、斑點貓鯊(Scyliorhinuscanicula)[12]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[13]、海參斑魚(Cyclopteruslumpus)[14]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[15-16]、海鱸(Dicentrarchuslabrax)[17]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[18]、太平洋鱈魚(Gadusmacrocephalus)[19]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[20]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[21-22]等.

在一些物種中存在一個以上IL-1β基因[15,22].最新的研究表明，在新真骨魚亞群(Neoteleostei)、原棘鰭總目(Protacanthopterygii)以及更高等的魚類中存在兩種不同的IL-1β[14-16,21-26].同一物種的兩種IL-1β基因具有很高的序列一致性，并被認為可能是在特定魚類譜系(如虹鱒魚和鯉魚)或在串聯基因復制后(如鯰魚)發生的進一步基因組復制事件的結果[15].通過對基因結構和共線性基因分析比較，將硬骨魚中編碼IL-1β的基因分為兩種類型：Ⅰ型(IL-1β2)和Ⅱ型(IL-1β1)[14,24].

在高等脊椎動物中，IL-1β的側翼基因較為保守.對不同脊椎動物IL-1β基因的共線性分析顯示，魚類IL-1β的連鎖基因與四足動物相比存在較大差異.這一研究表明，基因在染色體上的定位可能與生活條件的變化有關，其中，水環境被認為是影響脊椎動物進化的重要因素[27].CKAP2L是人類和硬骨魚IL-1β基因座之間唯一的共同基因，與硬骨魚IL-1β1基因緊密連鎖，但在硬骨魚IL-1β2基因座中缺失[24].對于大多數脊椎動物而言，CKAP2L基因位置鄰近IL-1β基因，這暗示著該基因座可能出現在大約3.1億a前——鳥類和哺乳動物的分化之前[7,13].IL-1β1和IL-1β2基因座之間也存在一定的相似性，例如：與CNNM4和PURB基因的接近度，這表明硬骨魚IL-1β基因是人類IL-1β的直系同源基因，且兩種類型的IL-1β可能起源于硬骨魚特異性的第三輪全基因組復制(3R WGD)[14,23].

人、小鼠和大鼠(Rattusnorvegicus)IL-1Ra、IL-1α和IL-1β基因具有相似的“7外顯子-6內含子”結構，這表明基因復制事件可能促進了IL-1家族的產生過程[28-30].Gibson等人指出，在物種形成之前，在其共同祖先中已經形成了IL-1家族.當單個物種面臨一系列不同的挑戰時，這些基因可能受到了顯著的選擇性壓力，從而導致它們在基因組中的分散[7].人類第7號染色體上存在一個包含非哺乳動物IL-1β兩側大部分基因的基因座，這與Gibson等人關于IL-1配體基因的進化的觀點相一致.

對于IL-1Ra、IL-1α和IL-1β三者的進化起源關系，目前存在兩種假設：一是IL-1Ra由祖先IL-1基因復制產生而來，對應于兩棲動物出現的時間(3.2～4.0億a前)，而IL-1α和IL-1β的分離則被認為是最近發生的(2.7～3.0億a前)[28]；二是IL-1α首先從祖先IL-1中復制出來，與IL-1Ra和IL-1β的之間的差異相比，IL-1α與這兩種蛋白質的差異更大.由此推論，IL-1β和IL-1Ra的共同祖先是一個選擇性剪接的基因，該基因產生的一個轉錄本編碼了祖先IL-1β，而另一個轉錄本編碼IL-1Ra.當基因復制事件發生后，產生了編碼不同產物的兩個基因[28,31].近年來，在軟骨魚等古老的脊椎動物物種中陸續發現了IL-1β基因，可以肯定的是，IL-1β的起源很早.

2 魚類IL-1β的結構

成熟的IL-1β蛋白質結構中存在12個β-片層，折疊形成對受體結合至關重要的三葉草狀結構[32].IL-1β的C-末端保守區域存在一個IL-1家族特征基序：[FC]-xS-[ASLV]-x(2)-Px(2)-[FYLIV]-[LI]-[SCA]-Tx(7)-[LIVM][28](圖1)，該序列跨越IL-1β成熟體的第9～11個β-折疊[23].雞[7]和非洲爪蟾[9]的IL-1β均具有該特征序列，但在硬骨魚和軟骨魚中該特征序列出現細微差異[23].魚類的兩種IL-1β都具有IL-1家族的特征序列和β-三葉草結構.高等脊椎動物的IL-1β由IL1前體結構域和IL1結構域組成，其中,IL1結構域是保守存在的.而在部分魚類和圓口綱物種中缺少IL1前體結構域.有研究指出，IL1前體結構域的功能重要性較低，其唯一作用是阻止與IL-1R1的結合[33]，這解釋了不同物種間IL1前體結構域的同源性遠低于IL1結構域的現象.與其他脊椎動物一樣，魚類的IL-1β缺乏信號肽，目前認為IL-1β通過非經典的分泌途徑從細胞中釋放出來[34].

在哺乳動物中，IL-1β以無活性的前體形式產生并存在于細胞質中，炎癥小體激活可導致IL-1β成熟和分泌，以響應各種胞質危險信號[35-36].哺乳動物IL-1β前體經Caspase-1特異性切割第5個外顯子中Asp116處的Asp-X鍵(X表示疏水殘基)，形成具有生物學活性的成熟IL-1β[35].Caspase-1(ICE)識別位點在哺乳動物IL-1β序列中嚴格保守，在魚類的相應區域(如虹鱒IL-1β的第4個外顯子和海鱸IL-1β的第3個外顯子)并未發現ICE酶切位點[37-39].

Reis等使用定點誘變技術確定了雞IL-1β前體的ICE切割位點為Asp80，海鱸的切割位點為Asp100[40].在斑馬魚(Daniorerio)中，Caspase-1的兩個同系物Caspase A/B具有3個切割位點Asp88、Asp104和Asp122[41]，其中,Asp122對應于海鱸的切割位點，這是存在于所有脊椎動物IL-1β序列的保守天冬氨酸殘基.草魚IL-1β前體在Asn91位置被切割為成熟的IL-1β[11]，對應斑馬魚的Asp88位置.Chen等人發現大菱鲆(Scophthalmusmaxixus)Caspase切割IL-1β發生在Asp86處[42](圖1).

此外，IL-1β前體也可以被不同的胞外蛋白酶切割，如膠原酶、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、糜蛋白酶和顆粒酶A等[43-46].這一結果表明，盡管IL-1β裂解位點在不同物種中并不保守，但IL-1β的裂解在其發揮功能上是相對保守的，這有助于更好地了解硬骨魚類的先天免疫.

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3 魚類IL-1β的表達譜比較

通過同源克隆或借助細菌、脂多糖(LPS)等刺激以提高轉錄水平，目前已經在多種硬骨魚和軟骨魚中發現并鑒定了IL-1β基因序列.

3.1 魚類IL-1β的組織分布

在大多數硬骨魚中，IL-1β分子呈現出多組織分布的特點[11,14,19-20,47-56].然而，不同魚類的IL-1β具有不同的組織表達譜(表1).例如，草魚、香魚(Plecoglossusaltivelis)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)和重唇魚(Hemibarbuslabeo)的IL-1β在脾、鰓和頭腎中表達量較高[11,49-51]；而在黃鰭金槍魚(Acanthopagruslatus)中，IL-1β在腎臟和脾臟中弱表達，在肝臟、肌肉和心臟中不表達[55].黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的IL-1β則主要在體腎、血液和心臟中表達[53].在黃鱔(Monopterusalbus)中，IL-1β在腸、脾、肝和腦中有較強的表達，但在肌肉、頭腎、血液和心臟中的表達量較少[47].

在一些魚類中存在多拷貝的IL-1β基因，不同IL-1β亞型的表達組織存在一定的差異.在海參斑魚中，IL-1β1的表達變化很大，在白細胞、頭腎、皮膚黏液以及脾臟中轉錄水平較高，在性腺中最低.而IL-1β2在各組織的表達水平普遍較低，在肝臟中相對最高[14].斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)IL-1β1在肝臟、頭腎、脾臟、腸和肌肉中大量表達，在胃、腦、卵巢、皮膚和體腎中表達量較低.而IL-1β2除了在腦中表達水平較低外，在其他所有受試組織中均勻表達[54].

盡管IL-1β基因在不同魚類中的組織分布模式有所差異，但值得注意的是，魚類IL-1β分子主要在頭腎、脾臟等免疫相關組織以及鰓等黏膜免疫組織中高水平表達，這意味著IL-1β分子在魚類免疫系統中具有重要意義.IL-1β在不同器官中的表達譜的差異可能與不同魚種的免疫細胞系統不同有關，這有待進一步研究.

3.2 魚類IL-1β的刺激應答反應

IL-1β是一種關鍵的炎癥細胞因子，在宿主對病原體感染的免疫反應過程中扮演重要角色.先前的研究顯示，在應對不同的病原體刺激時，魚類IL-1β的表達模式變化呈現明顯的差異(表1).

感染溶藻弧菌(V.alginolyticus)顯著促進了大黃魚各組織中IL-1β基因的轉錄，其中，頭腎和鰓中的轉錄水平變化最為顯著[20]；在感染耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)后，虹鱒脾臟中兩種IL-1β的表達量增加數千倍[25]；嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的刺激作用能夠引起黃鱔頭腎和脾臟IL-1β大量表達[47]，提示IL-1β在抗菌反應中的重要作用.嗜水氣單胞菌的刺激可使大鰭鳠(Mystusmacropterus)IL-1β的表達量先上升后降低[59].與之相似的是，在愛德華氏菌(E.ictaluri)刺激后，斑點叉尾鮰頭腎中也出現了類似的趨勢[54]，這表明IL-1β參與魚體內的免疫反應，尤其是在抵抗病原體侵染的初期.

脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)可作為免疫系統的刺激物，被廣泛用于模擬細菌和病毒感染的刺激，引起魚類體內細胞因子的變化.LPS不僅可以刺激誘導軟骨魚IL-1β的表達[12]，也能增加硬骨魚(如重唇魚、黃鰭金槍魚)脾臟、腎臟等組織中IL-1β的表達量[11,13,17-18,51,55].在LPS刺激后，鮸魚各組織中IL-1β的轉錄水平均明顯上調[13]；大口黑鱸(Micropterussalmoides)脾臟中IL-1β mRNA表達水平升高，而在頭腎中無明顯變化[58].不同魚類物種應對LPS刺激產生了類似的應答反應，暗示著在這些魚類中可能存在一種共同的IL-1β調節機制.研究表明，魚病毒性神經壞死病病毒(VNNV)能夠上調金鯧魚(Trachinotusovatus)肝臟、脾臟、腎臟等組織中IL-1β的表達[52].病毒模擬物PolyI:C促進了鮸魚的多種組織中IL-1β表達量增加[13]，但僅略微提高黃鱔頭腎白細胞mRNA表達水平[47].同樣，黑魚(Channaargus)頭腎白細胞IL-1β也可被脂磷壁酸(LTA)、LPS和PolyI:C誘導表達[48].這些結果表明IL-1β在魚類應對細菌和病毒感染過程中行使關鍵功能.

與哺乳動物的胸腺和骨髓構成的中樞免疫系統不同，魚類的免疫相關組織為頭腎、脾臟和血液.致病菌、病毒主要通過皮膚和鰓等途徑感染魚類，隨后傳播到其他內臟器官，其中，肝臟、脾臟和腎臟是感染后發生大量病原體侵入和增殖的主要器官.在多種魚類中，IL-1β在鰓中的轉錄水平顯著高于其他組織[11,20,48,51-52]，經病原體刺激后表達量顯著增加，這可能暗示IL-1β在鰓中參與了這些魚的急性炎癥反應.

4 魚類IL-1β的功能研究

IL-1β是一種具有多效性的細胞因子，參與宿主防御微生物入侵、炎癥、免疫應答、代謝調節、造血過程和腫瘤轉移等一系列反應[1,3-4].IL-1β主要由哺乳動物的單核細胞和巨噬細胞產生[6,61]，也由T細胞、NK細胞、內皮細胞、成纖維細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、腎上腺皮質細胞[62-63]和胰腺β細胞[64]等產生.IL-1β能夠影響重要的細胞功能，例如:降低DNA含量、減少蛋白質合成和細胞內能量產生，誘導β細胞凋亡和壞死[3-4].

4.1 IL-1β相關信號通路研究

在哺乳動物中，IL-1β與Ⅰ型受體IL-1R1結合，在受體輔助蛋白IL-1RAP的幫助下募集含有TIR結構域的銜接蛋白MyD88[1-2,65].MyD88向下游傳遞信號激活白介素1受體相關激酶IRAKs和腫瘤壞死因子受體相關因子TRAF6.該信號促進與炎癥和免疫反應相關的關鍵轉錄因子的激活，例如：NF-κB、AP-1、JNK、MAPK和ERK等[1-6,65].

對海參斑魚的轉錄組數據分析顯示，NF-κB和MAPK通路的大部分成員在海參斑魚中均已存在[14]，這意味著在魚類中可能存在類似于哺乳動物的信號通路.在細菌刺激后，除了促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α和COX-2)外，上調最高的2個分子分別是IκBa和IL-1R2，它們也參與了IL-1β的調節過程[14].在日本牙鲆中，通過微陣列分析發現，注射10 μgIL-1β基因的表達載體可誘導其頭腎組織中93個基因的高表達，其中，包括TNF、TLR1、GCSF、MHCⅠ、β2-MG、IgM、CD3、CD20等[21]；在草魚體內的研究發現，重組草魚IL-1β可通過NF-κB和MAPK6信號通路同時上調草魚頭腎白細胞IL-1β和TGF-β1的表達.有研究指出，鯛魚重組IL-1Fm2與PAMP聯合使用時，能夠激活金頭鯛(Sparusaurata)吞噬細胞的呼吸爆發并協同誘導IL-1β的表達[23].此外，海參斑魚nIL-1F能夠抑制IL-1β1的表達，這一現象在草魚中同樣被證明[14,66]，這表明魚類的nIL-1F是一種類似于哺乳動物的IL-1Ra的受體拮抗劑，通過與IL-1R1結合進而阻斷下游信號.目前，魚類IL-1β的功能尚不完全清楚，但它在先天免疫過程中激活吞噬細胞的活性，并且同Toll樣受體(TLR)之間也存在關聯作用.

4.2 魚類IL-1β的抗菌、殺菌功能研究

到目前為止，大量的研究表明魚類IL-1β參與了病原體感染后的炎癥反應.為了進一步研究IL-1β在魚類中的抗菌、殺菌作用，多種重組魚類IL-1β(rIL-1β)蛋白及抗體被生產出來.

研究發現：注射IL-1β基因的鯉魚對嗜水氣單胞菌感染的抵抗力增加[67]；虹鱒重組IL-1β蛋白可以誘導體內巨噬細胞中COX-2和MHC Ⅱ的表達，腹腔注射僅1 μg rIL-1β即可增強腹腔白細胞的遷移和頭腎巨噬細胞的吞噬功能，從而顯著降低殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)感染導致的魚類死亡率[68]；重組黑魚IL-1β上調了頭腎白細胞中內源性IL-1β的表達，同時在細胞內殺菌實驗中顯著降低了細菌的存活率，說明rIL-1β提高了黑魚頭腎白細胞的殺菌能力[48]；重組IL-1β可增強大黃魚對溶藻弧菌的抵抗力，并在體外增加頭腎巨噬細胞的遷移和吞噬活性[20]；在香魚中，抗IL-1β抗體的中和作用降低了頭腎單核/巨噬細胞的殺菌能力，但不改變它們的吞噬功能[49]；在草魚中，抗IL-1β抗體可抑制嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥[11].

研究證實，注射重組魚類IL-1β可上調魚類內源性IL-1β的表達，同時增強單核/巨噬細胞的遷移和吞噬細菌能力；而抗IL-1β抗體降低真核/巨噬細胞的殺菌能力.最近，在大菱鲆中研究顯示，過表達IL-1β抑制了愛德華氏菌(E.ictaluri)在大菱鲆體內的定殖，而敲除IL-1β則在早期促進細菌在鰓中的定殖[42].這些研究表明，與哺乳動物IL-1β一樣，魚類IL-1β在抗菌防御中發揮重要功能，有助于機體抵御細菌感染.

4.3 魚類IL-1β的佐劑效應研究

IL-1β具有廣泛的生物學活性，主要參與調節炎癥反應和誘導免疫應答.近年來，IL-1β被認為是哺乳動物[69-71]和魚類[54, 72-74]疫苗的潛在免疫刺激劑.基于哺乳動物IL-1β進行序列比對，預測可能的成熟肽.結果顯示，重組硬骨魚IL-1β蛋白具有生物學活性，可引起一系列免疫反應[11,20,48,68].

在斑點叉尾鮰中，rIL-1β1和rIL-1β2蛋白通過提高抗體水平、血清殺菌活性、溶菌酶活性、替代補體溶血活性，增強了聯合注射疫苗后的免疫應答[54].類似地，將重組IL-1β蛋白與滅活細菌同時注射鯉魚體內，可產生更高的抗體凝集水平[73]；在牙鲆中使用重組IL-1β作為佐劑可以提高針對抗原、牛血清白蛋白或綠色熒光蛋白的抗體效價[72].此外，給鯉魚喂食含皂苷(動物的免疫反應和抗體反應的良好佐劑)的豆粕后，IL-1β表達量的上調暗示其參與鯉魚腸中豆粕誘導的腸炎的發病和恢復[75].

由此可知，魚類IL-1β在免疫調節過程中發揮重要作用.重組魚類IL-1β具有促炎性作用，與疫苗聯合注射后，明顯增加了抗體效價.這表明，魚類IL-1β可作為細菌亞單位疫苗的潛在佐劑，應用于水產養殖中.

5 總結與展望

IL-1β作為一種促炎細胞因子，廣泛參與魚類體內的炎癥和免疫調節活動.近年來，已經在越來越多的魚類中克隆得到IL-1β基因.研究發現，魚類IL-1β蛋白在結構上與哺乳動物有很多相似性.目前，對魚類IL-1β功能的研究主要集中在病原體刺激后其在轉錄水平上的表達變化.大量的研究表明，魚類IL-1β有助于機體抵御病原微生物的感染.此外，重組魚類IL-1β蛋白可作為很好的佐劑，增強聯合注射疫苗后的免疫應答.以上結果均表明，魚類IL-1β在免疫調節過程中扮演著類似哺乳動物IL-1β的重要角色.然而，有關魚類IL-1β功能的研究還不夠深入和全面，仍有很多問題亟待更深入的研究：①IL-1β在魚體中參與炎癥反應的機制以及與哺乳動物信號通路之間的異同；②魚類IL-1β是否參與了其他生命活動，如造血、代謝過程等；③可用于疫苗接種的更多魚類物種的IL-1β.隨著科技的進步和研究的深入，魚類免疫調節機制等問題將逐漸被解決，這對魚類疾病的防治具有重要意義，并為低等脊椎動物免疫系統的研究提供參考借鑒.