全自動二維液相色譜測定替考拉寧血藥濃度

馬愛玲，王漪檬，張偉，馬培志

(河南省人民醫院藥學部，鄭州大學人民醫院，河南 鄭州 450003)

替考拉寧(teicoplanin)為游動放線菌屬發酵產生的一種新型殺菌性糖肽類抗菌藥物，通過抑制細菌細胞壁的合成來抑制細菌生長。替考拉寧是繼萬古霉素之后的又一抗耐藥菌藥物，臨床可用于治療各種嚴重的革蘭陽性菌感染，特別是對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染有很好的療效，是目前臨床治療多重耐藥菌感染的重要抗生素[1]。近年來研究及臨床實踐中發現，替考拉寧臨床應用個體差異大，有效血藥濃度達標率低，尤其是高齡老年、重癥患者等特殊人群，其病理生理的改變等因素導致藥物分布與清除發生變化，進而影響血藥濃度及治療效果，監測替考拉寧血藥濃度的必要性已被越來越多的研究所證實。因此，醫生在使用替考拉寧進行治療時，需及時對替考拉寧的血藥濃度進行監測。替考拉寧由 10～11碳脂肪鏈組成，主要成分有5種，分別為TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5，其中以TA2-2為主，占總含量的40%以上，這些組分的極性和生物活性相似，為無定形粉末[2]。實驗室在進行替考拉寧血藥濃度監測時，多以TA2-2為監測目標。文獻研究表明，患者的年齡、血漿蛋白水平及是否給予負荷劑量對替考拉寧血藥谷濃度影響較大，以上影響因素常單一或多個存在于患者個體中，使得按推薦的標準劑量給藥難以達到有效血藥濃度或超過不良反應預警濃度，從而發生治療無效、誘發耐藥性或增加不良反應的情況[3]。因此，推薦在臨床應用中積極開展替考拉寧血藥濃度監測，為醫生開具處方提供科學依據，也為患者的合理用藥提供有力保障。本研究采用全自動二維液相色譜測定替考拉寧血藥濃度的方法，操作簡便快速，結果準確，自動化程度高，適用于臨床工作中監測替考拉寧的血藥濃度。

1 材料

1.1 儀器全自動二維液相色譜(FLC-2701+LC-20A+SPD-20A)系統由全自動二維液相色譜耦合儀FLC-2701(湖南德米特儀器有限公司)及島津液相色譜LC-20A部件構成。SC-3610低速離心機(安徽中佳)；AUW120D電子天平(日本島津)；WH-866旋渦混合器。

1.2 藥品與試劑替考拉寧-1D移動相；替考拉寧-2D移動相；水為超純水；替考拉寧對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號130374-201002)；MPI-1(湖南德米特儀器有限公司)；空白馬血清(北京政博偉業生物科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件一維流動相為替考拉寧-1D移動相，二維流動相為替考拉寧-2D移動相，輔助試劑為超純水。流速：A泵為1.2 mL·min-1，B泵為2.0 mL·min-1，C泵為0.8 mL·min-1。紫外檢測波長為278 nm和254 nm。柱溫40 ℃。進樣量100 μL。時間程序0.01～4.00 min目標物轉移至中間柱；4.01～6.00 min目標物從中間柱轉移至二維色譜柱；6.01～13.50 min目標物在第二維色譜中完成分離。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品貯備液的制備 精密稱取替考拉寧對照品24.00 mg于10 mL量筒中，用體積分數10%的甲醇溶解并定容，制備成2.40 g·L-1的替考拉寧對照品貯備液，置于-30 ℃ 冰箱中保存備用。

2.2.2質控血清的制備 精密量取替考拉寧對照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質量濃度質控血樣，置于-30 ℃冰箱中保存備用。

2.3 樣品處理及測定精密吸取1 000 μL MPI-1至1.5 mL離心管中，加入400 μL血樣，渦旋振蕩1.0 min；15 000 r·min-1高速離心8.0 min，取上清1 000 μL進樣分析。

2.4 專屬性試驗分別將空白馬血清、40 mg·L-1的替考拉寧中質量濃度質控品按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。替考拉寧以11.50 min的色譜峰(替考拉寧TA2-2的色譜峰)計，血清內源性物質及其他雜質均不干擾樣品的分離測定，結果表明該方法專屬性好。

A為空白馬血清；B為替考拉寧對照品；＊為替考拉寧TA2-2的色譜峰。

2.5 線性關系考察精密量取替考拉寧對照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成3.75、7.50、15.00、30.00、60.00、120.00 mg·L-1的替考拉寧系列混合標準血樣，將制備好的系列混合標準血樣按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進樣分析，以峰面積Y對質量濃度X做線性回歸方程：

Y=3 149.67X-1 738.91。

式中：Y為峰面積，單位為mV·min；X為質量濃度，單位為mg·L-1。

r=0.999 9，線性范圍為3.75～120.00 mg·L-1。結果表明替考拉寧在3.75～120.00 mg·L-1范圍內，線性良好。

2.6 精密度試驗精密量取替考拉寧對照品貯備液適量，分別加入適量空白馬血清，制成40.00 mg·L-1的替考拉寧中質量濃度質控血樣，按2.3部分方法處理，按2.1部分色譜條件進樣分析，連續進樣6次，考察儀器精密度。結果RSD為1.6%，表明該方法精密度良好。

2.7 回收率試驗按2.2.2部分制備10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質量濃度質控血樣，每個水平的質控樣品平行制備3份樣品，按2.3部分方法處理后進樣分析，考察方法回收率。結果低、中、高質控的回收率分別為98.9%，98.2%，98.0%，表明該方法回收率良好。

2.8 穩定性試驗按2.2.2部分制備10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉寧低、中、高質控血樣，每個水平的質控制備6份樣品，分別考察室溫下24 h以及-30 ℃冰箱保存30 d的穩定性，結果在兩個條件下保存后，質控血樣中替考拉寧的含量變化均小于5%，穩定性試驗結果表明替考拉寧在血清中穩定性良好。

2.9 臨床應用收集河南省人民醫院2020年1月至2020年3月在重癥監護室住院患者的血樣，進行替考拉寧血藥濃度監測，共檢測11例。參考《治療藥物監測臨床應用手冊》[4]中推薦監測替考拉寧穩態谷濃度>10 mg·L-1，檢測結果中有5例樣本替考拉寧的血藥濃度高于10 mg·L-1，達到目標血藥濃度的樣本量僅占總樣本量的45.45%。以上結果分析顯示，達到臨床有效血藥濃度者不足一半，臨床上應給予重視。在使用替考拉寧進行治療時，醫生應及時監測替考拉寧血藥濃度，進而促進合理用藥。

3 討論

目前，國內開展替考拉寧治療藥物監測的工作還處于起步階段，查閱相關文獻發現臨床工作中測定替考拉寧血藥濃度的方法主要有高效液相色譜法[5-10]和液相色譜-質譜法[11-15]，血樣的預處理方法多采用乙腈沉淀蛋白及二氯甲烷或三氯甲烷萃取，該處理方法操作繁瑣并且耗時較長，不適于批量處理。并且這類方法在前處理時用到的乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷等有機試劑毒性較大，日常使用時會對工作人員造成一定傷害，所以該方法并不適合臨床大批量的檢測。有研究在血樣處理時采用了Centrifree超濾裝置，該裝置可以截留分子量>30 000的物質，但是整個處理過程需要在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在37 ℃，1 500×g下離心 30 min，樣品前處理耗時較長，所以處理過程雖然相對沉淀蛋白的方法較安全，但是整個處理過程相對繁瑣[11]。本研究中，前處理方法用時約10 min，并且相對安全，操作簡單、方便，適于批量處理。另外液相色譜-質譜法對實驗室以及操作人員的專業要求較高，該方法不適于在基層醫院開展。

本研究建立的全自動二維液相色譜測定替考拉寧血藥濃度的方法具有前處理簡單、測定快速、靈敏度高、準確性好、穩定性強等特點，能滿足臨床報告對及時性、準確性和測定范圍的要求，可以作為臨床監測血藥濃度的有效方法。