定向栽培連作淮山根際土壤細菌群落的多樣性分析

周靈芝，勞承英，申章佑，李艷英，黃渝嵐，韋本輝，胡 泊，周 佳

(廣西農業科學院經濟作物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】淮山又稱山藥，是薯蕷科薯蕷屬(Dioscorea)一年生或多年生草質藤本植物[1]，是我國著名的補益中藥，也是菜糧藥兼用的高效經濟作物[2-4]，市場需求旺盛。但淮山連作極易形成連作障礙，造成淮山長勢衰弱、病害嚴重，極大影響淮山的產量和品質，是制約淮山產業健康發展的重要因素，研究解決淮山連作障礙已成為淮山生產上亟需解決的問題。在已有對淮山連作的研究中，較多采用平板培養法統計土壤微生物的菌落數量，但此法獲得純培養土壤微生物菌株的種類數量僅占微生物總數的0.1%～1.0%，難以從根本上揭示淮山連作土壤微生物的群落結構及其變化特征。而高通量測序技術具有高通量、高靈敏度、高準確性和低運行成本等特點，可更全面、更準確地揭示土壤微生物群落的復雜性和多樣性[5]。因此，利用高通量測序分析連作淮山根際土壤細菌群落結構，對研究淮山連作障礙具有重要意義。【前人研究進展】在土壤中生存數量巨大、種類繁多的微生物是土壤生態系統的主要組成部分[6]，亦是緩解作物連作障礙及其他土壤障礙因子的重要因素[7]。土壤中的有益微生物可促進作物生長發育，有害微生物則會抑制作物正常生長發育[8]。孫凱寧等[9]采用稀釋涂抹平板法研究發現，淮山連作破壞了土壤耕層微生物種群結構，其細菌數量隨著淮山連作年限的延長呈遞減趨勢，輪作模式則促進土壤細菌數量增加。馬瑩[10]研究認為，隨著淮山連作年限的延長，土壤微生物的組成和數量排序表現為連作兩年土壤>對照土壤>耕作一年土壤。土壤微生物在總體數量上均以細菌為主，隨著連作年限的增加，可培養的微生物總量呈上升趨勢。王文慶[11]研究表明，在淮山連作時其根際微生物區系的微生物菌群結構發生了由“細菌主導型”向“真菌主導型”轉化。喬卿梅等[12]研究顯示，根際土壤細菌、放線菌和真菌均隨著淮山藥生長期的延長呈顯著上升趨勢，三者在11月的絕對數量分別是7月的2.11、1.70和26.19倍，尤其以真菌的增長速度更快。張紅霞等[13]利用高通量測序發現變形菌、綠彎菌、酸桿菌和放線菌是連作山藥根際土壤細菌的優勢種群，其相對豐度均大于5.0%，占總序列的85.1%。【本研究切入點】淮山定向栽培技術在南方已大面積推廣應用[14]，但目前利用高通量測序技術研究定向栽培淮山連作對其根際土壤細菌多樣性影響的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過Illumina HiSeq高通量測序平臺探究定向栽培淮山根際土壤細菌群落的結構特征，探明定向栽培淮山連作的細菌群落變化情況，為進一步解決淮山連作障礙提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年3月至2020年3月在廣西南寧市隆安縣那桐鎮大滕村試驗基地(東經107°52′22″，北緯22°58′11″)進行，土壤類型為紅壤，年均氣溫21.8 ℃，年均降水量約1300 mm，日照充足。

1.2 試驗材料

田間種植的淮山品種為桂淮2號，采集其根際土壤為試驗材料。桂淮2號由廣西農業科學院經濟作物研究所選育提供。該品種屬于小葉型中晚熟品種，薯塊長圓柱形，長50～100 cm，表皮棕褐色、光滑，肉質細膩；單株薯重0.6～1.0 kg，產量約22 500 kg/hm2。

1.3 試驗方法

設連作淮山(T)(定向栽培2年淮山)和空白露地(位于T處理旁邊，第1年種植淮山而第2年未種植淮山)(對照，CK)兩個處理。

1.3.1 土壤樣品采集 2020年3月T處理收獲期進行土壤樣品采集。在試驗地內選取20個取樣點，撥開淮山定向管的表土層，用手將淮山輕輕取出，抖掉根系上松散的大土塊，然后用刷子將與根系緊密結合的土壤刷下作為1個根際土壤樣品。土樣在田間充分混勻，并剔除根系、雜草等雜物，每個土樣分成2份：1份裝于無菌離心管，放入裝有冰袋的取樣箱帶回實驗室，存放于-80 ℃冰箱，用于土壤細菌群落結構多樣性分析；另1份置于室內風干，用于測定土壤理化性質。CK取樣時先清除厚約1.0 cm的表層土壤，再挖取第1年淮山種植帶中的耕層土壤，去除雜物等操作與T處理相同。T處理和CK各3個重復，共6個樣品。

1.3.2 高通量測序 土壤樣本委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序，以細菌V3-V4區特異性引物(338F-806R)進行PCR擴增。

1.3.3 測序數據生物信息學分析 測序數據通過Flash和Trimmomatic進行過濾優化和雙端序列連接，優化的序列利用Usearch在97%相似水平進行聚類，得到各樣品可操作分類單元(OTU)的代表序列，采用Mothur對OTU進行Alpha多樣性和β多樣性分析，計算Chao l、Ace、Shannon和Simpson指數；利用R語言工具分析和制圖(Venn圖和群落柱形圖)。參考Silva細菌數據庫利用RDP classifier進行物種注釋和分類。

1.3.4 土壤理化性質測定 參照魯如坤[15]方法，土壤pH采用酸度計測定，水解性氮含量采用堿解擴散皿滴定法測定，有效磷含量采用鉬銻抗比色法測定，速效鉀含量采用乙酸銨浸提—火焰光度計法測定，有機質含量采用重鉻酸鉀硫酸氧化—滴定法測定。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 17.0進行統計分析，以Duncan，s新復極差法進行多重比較，以Pearson系數進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 連作淮山根際土壤細菌群落高通量文庫結果評價

基于細菌16S rRNA基因分析，對6個土壤樣品進行Illumina MiSeq高通量測序，經過濾優化，共得到有效序列230961條，序列長度分布在234～531 bp，在97%相似水平上聚類獲得3423個OTUs，分屬于33門95綱242目395科780屬1524種。其中，T處理根際土壤細菌群落獲得3076個OTUs，分屬于33門93綱237目387科767屬1471種；CK根際土壤細菌群落獲得2035個OTUs，分屬于27門75綱180目273科496屬905種(圖1)。

由表1可知，T處理和CK土壤樣品文庫的覆蓋率均較高，分別為98.42%和98.91%，說明土壤樣品的測序文庫已達飽和狀態，所構建文庫已包含樣品中的大部分細菌種類，能較好地反映土壤的細菌群落結構。

2.2 連作淮山根際土壤細菌群落的物種Venn圖分析

從圖1可看出，T處理和CK根際土壤共有的OTUs數為1688個，特有的OTUs數分別為1388和347個。經方差分析，二者的OTUs數差異極顯著(P<0.01，下同)。說明連作淮山根際土壤中細菌群落的OTUs分布與CK相比既有共性又存在極大差異。

2.3 連作淮山根際土壤細菌群落的多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析結果 分別對細菌菌群豐富度指數(ACE指數和Chao l指數)和細菌群落多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)進行分析。由表1可知，與CK相比，T處理土壤細菌的Shannon指數極顯著上升，升幅達12.8%，而Simpson指數極顯著下降，降幅為57.1%。說明連作淮山根際土壤細菌群落的多樣性極顯著高于CK。

從表1還可看出，T處理土壤細菌的ACE指數和Chao l指數均大幅上升，升幅分別為50.8%和49.4%，與CK差異極顯著。說明淮山連作后其根際土壤細菌群落的多樣性和豐富度都發生了顯著變化。

表1 連作淮山根際土壤的細菌多樣性指數

2.3.2 β多樣性分析結果 從圖2可看出，T處理和CK土壤樣品分布離散、距離較遠，表明二者土壤樣品間的細菌群落結構差異較明顯；第一主成分(PC1)對細菌群落結構的差異性貢獻率為81.44%，T處理土壤樣本點與PC1軸距離較近，說明連作淮山土壤根際細菌菌群結構受PC1影響較大；第二主成分(PC2)對細菌群落結構的差異性貢獻率為14.49%，CK土壤樣本點與PC2軸距離較近，說明CK土壤細菌菌群結構受PC2影響明顯。可見，本研究中土壤細菌群落的PC1和PC2能解釋95.93%的樣品間差異性，連作淮山根際土壤的細菌群落結構與CK存在明顯差異。

2.4 連作淮山根際土壤的細菌群落組成分析

2.4.1 細菌優勢菌門的分析結果 在門分類水平上連作淮山根際土壤的細菌群落隸屬于33門，CK土壤的細菌群落隸屬于27門。從圖3可看出，放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)等12個已知菌門(相對豐度>1.00%的菌門屬于優勢菌門)在T處理和CK土壤細菌群落中的占比分別為98.04%和98.55%，其中，T處理土壤細菌群落中相對豐度排在前10位的優勢菌門依次為放線菌門(26.86%)、變形菌門(25.46%)、厚壁菌門(12.62%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(10.62%)、酸桿菌門(Acidobacteriota)(7.72%)、擬桿菌門(Bacteroidota)(5.17%)、粘球菌門(Myxococcota)(3.59%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)(1.82%)、浮霉菌門(Planctomycetota)(1.49%)和Patescibacteria(1.36%)，而CK土壤細菌群落中相應細菌門的相對豐度分別為30.55%、11.99%、8.69%、31.79%、7.32%、0.27%、0.83%、12.83%、2.34%和0.88%。說明連作淮山根際土壤細菌群落組成在門水平上與CK存在較大差異。

門分類水平上對物種相對豐度進行方差分析，結果(圖4)表明，在T處理土壤細菌群落相對豐度排前12位的優勢菌門中，變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、粘球菌門、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobiota)和WPS-2等7個優勢細菌門的相對豐度與CK存在顯著差異(P<0.05，下同)。其中，變形菌門、擬桿菌門、粘球菌門、Patescibacteria和疣微菌門等5門的相對豐度顯著大于CK，綠彎菌門和WPS-2顯著小于CK。說明連作后淮山根際土壤優勢細菌在門水平上的相對豐度與CK存在較大差異。

2.4.2 細菌優勢菌屬的分析結果 在屬分類水平上連作淮山根際土壤的細菌群落隸屬于767屬，其中，相對豐度>1.00%的有20屬，而CK土壤的細菌群落隸屬于496屬，相對豐度>1.00%的有25屬；相對豐度>1.00%的T處理和CK土壤細菌群落的優勢菌屬共有37個，其中有18屬在分類學數據庫中為分類學譜系的中間等級，無科學名稱，因此用norank或unclassified標記。由表2可知，T處理排名前20位的優勢菌屬和豐度與CK存在較大差異，其中，僅有芽孢桿菌屬(Bacillus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、norank_JG30-KF-CM45、熱酸菌屬(Acidothermus)和Bryobacter同為T處理和CK土壤細菌群落共有的優勢菌屬，T處理排名前10位的優勢菌屬均未出現在CK排名前10位的優勢菌屬中；而T處理根際土壤細菌中出現了有益菌屬鏈霉菌屬(Streptomyces)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。說明淮山連作的優勢菌屬與CK差異較明顯。

表2 連作淮山根際土壤細菌群落排名前20位優勢細菌屬的相對豐度比較

2.5 淮山連作根際土壤細菌主要群落與土壤理化性質的關系

2.5.1 連作淮山根際土壤的理化性質 由表3可知，T處理和CK的土壤均偏酸性，但T處理土壤的pH為6.33，極顯著高于CK(4.83)；T處理土壤的水解氮、有效磷和速效鉀含量分別為176.23、88.77和1010.70 mg/kg，有機質含量為54.47 g/kg，均極顯著高于CK。可見，淮山連作后其根際土壤的理化性質發生了極明顯的變化。

表3 連作淮山根際土壤的理化性質

2.5.2 連作淮山根際土壤主要細菌菌群與土壤理化性質的相關分析 對T處理土壤在門水平相對豐度>1.00%的主要細菌群落與土壤理化因子進行Pearson相關分析，結果(表4)表明，在相對豐度排名前12位的主要細菌菌門中，有7個細菌門與土壤理化性質呈顯著(P<0.05，下同)或極顯著相關。其中，變形菌門與pH及水解氮、速效鉀和有機質含量呈極顯著正相關，與有效磷含量呈顯著正相關；綠彎菌門與pH及水解氮、速效鉀和有機質含量呈極顯著負相關；擬桿菌門與pH及水解氮、速效鉀和有機質含量呈極顯著正相關，與有效磷含量呈顯著正相關；粘球菌門與pH及水解氮、速效鉀和有機質含量呈極顯著正相關，與有效磷含量呈顯著正相關；Patescibacteria與pH及水解氮、速效鉀和有機質含量呈顯著正相關；疣微菌門與有效磷含量呈極顯著正相關，與水解氮、速效鉀和有機質含量呈顯著正相關；WPS-2與pH、水解氮、有機質含量呈極顯著負相關，與速效鉀含量呈極顯著正相關。說明pH及水解氮、速效鉀和有機質含量是影響連作淮山根際土壤細菌群落組成的重要因子，而速效磷含量對細菌群落組成的影響較小。

表4 連作淮山根際土壤主要細菌菌群與土壤理化性質的相關分析結果

3 討 論

淮山屬于極易發生連作障礙的作物，有些地方淮山連作兩年即出現不同程度的爛根現象[11]，嚴重制約淮山產業的可持續發展。前人對連作馬鈴薯[16]、西瓜[17]、草莓[18]等的研究發現，連作導致土壤微生物環境和微生物群落結構發生改變是其發生連作障礙的原因之一。本研究通過高通量測序對定向栽培連作淮山根際土壤和CK土壤樣品進行細菌序列測定，結果發現該2種土壤除存在共有的細菌類群外，還存在具有極大差異的細菌群落，與胡彥婷等[19]對連作胡蘿卜的研究結果相似。

土壤樣品中的微生物多樣性通常以Shannon指數和Simpson指數表示，前者數值越大，表明群落多樣性越高，后者數值越大，表明群落多樣性越低。細菌菌群的豐富度常用ACE指數和Chao l指數表示，其數值越大表明細菌群落越豐富。本研究中，連作淮山土壤細菌的Shannon指數、ACE指數和Chao l指數與CK相比均顯著上升，升幅分別為12.8%、50.8%和49.4%；連作淮山土壤細菌的Simpson指數極顯著下降，降幅為57.1%。表明淮山連作可導致其根際土壤細菌群落的多樣性和豐富度增加，與前人對連作木薯[20]、煙草[21]、花生[22]等作物的研究結果一致，但與呂昭和等[16]、楊尚東等[23]、周冰謙等[24]研究認為連作會降低作物根際土壤細菌群落多樣性的觀點不一致，可能與作物種植地的氣候、土壤類型、連作年限和田間管理措施不同等有關。

本研究中，連作淮山根際土壤細菌群落的優勢菌門有放線菌門、變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和擬桿菌門等，與張紅霞等[13]對山藥的研究結果相似。其中，變形菌門、擬桿菌門、粘球菌門、Patescibacteria和疣微菌門等5門的相對豐度顯著大于CK；連作淮山和CK根際土壤細菌群落的優勢菌屬(相對豐度>1.00%)共有37個，但僅芽孢桿菌屬、慢生根瘤菌屬、norank_JG30-KF-CM45、熱酸菌屬和Bryobacter等5屬為二者排名前20位優勢菌屬中的共有菌屬，表明在細菌屬水平上連作淮山與CK的優勢菌屬差異較明顯；連作淮山根際土壤細菌群落中出現鏈霉菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等有益菌優勢菌屬，可能與淮山連作過程中施用有機肥有關。本研究僅為2年的試驗數據，為更明確淮山連作后其土壤菌屬的變化規律，還需結合淮山連作后病害發生狀況及淮山產量和品質等性狀等進行跟蹤研究，才能最終篩選出引起淮山連作障礙的致病菌株，為解決淮山連作障礙提供精確的科學依據。

本研究結果表明，在連作淮山根際土壤細菌群落的12個主要細菌門中，有7個細菌門與土壤pH及水解氮、速效鉀和有機質含量等理化性質呈顯著或極顯著相關，表明土壤理化性狀改變是引起微生物群落組成發生變化的原因之一，與秦紅靈等[25]和趙帆等[26]報道的結果一致。

4 結 論

定向栽培連作淮山可導致其根際土壤細菌多樣性和豐富度發生變化，增加大量特有細菌，其根際土壤細菌的Shannon指數、ACE指數和Chao l指數均顯著上升，優勢細菌群落主要為放線菌、變形菌、厚壁菌、綠彎菌和酸桿菌。土壤pH及水解氮、速效鉀和有機質含量變化是影響連作淮山土壤細菌群落組成發生變化的重要因子。