茉莉酸和水楊酸誘導(dǎo)胡椒抗瘟病中生理生化的變化研究

蘇岳峰，鄭其向，馬 曉，李家慶，伍寶朵，胡麗松，范 睿*

(1.海南大學(xué)，海南 海口 570000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 普洱 665000)

【研究意義】胡椒(PipernigrumL.)是胡椒科(Piperaceae)胡椒屬(Piper)多年生常綠藤本植物，原產(chǎn)于印度，素有“香料之王”、“黑色黃金”的美譽，在人類歷史文明進程中占有獨特地位[1]。據(jù)統(tǒng)計，世界胡椒種植面積達5.53×105hm2，總產(chǎn)量達4.33×105t，目前中國胡椒種植面積近4×105hm2,年總產(chǎn)量近4×104t，主要分布在云南、海南、廣東、福建和廣西等省(區(qū))，其中海南主產(chǎn)區(qū)，年均產(chǎn)值高達20多億元、已發(fā)展成為百萬人口經(jīng)濟來源的支柱產(chǎn)業(yè)[2]。然而，在胡椒產(chǎn)業(yè)中，胡椒瘟病作為一種季節(jié)性土傳性病害，常引發(fā)植株木質(zhì)部褐化，導(dǎo)管變黑腐爛等病狀。病情嚴重時致?lián)p高達90%及以上，甚至全園毀滅、顆粒無收[3]，嚴重制約著中國胡椒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。【前人研究進展】針對胡椒瘟病病害，張開明[4]等研究表明，辣椒疫霉(Phytophthoracapsic)是中國胡椒瘟病的主要病原菌，寄主范圍廣，氣候依賴性強，可侵染可可、山龍眼等熱帶水果和飲料植物以及辣椒、黃瓜等茄科和葫蘆科作物[5]，已成為熱區(qū)植物的災(zāi)害性病菌。國內(nèi)外在辣椒作物上用化學(xué)殺菌劑、生物拮抗菌開展了較為系統(tǒng)的防治研究，分離出附生細菌金屬芽孢桿菌、洋蔥芽孢桿菌等生防菌，但殺菌劑的副作用和拮抗菌的寄生性對寄主的危害依然存在較多的爭論[6]。近年來，植物外源誘導(dǎo)劑——茉莉酸(jasmonic acid, JA)、水楊酸(salicylic acid, SA)等作為誘導(dǎo)抗性信號的基本組分，使植物產(chǎn)生抗病性，介導(dǎo)抗性信號激活[7]，形成精巧的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和偶聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、精密地控制各激素的整體水平，成為近年來抗病研究的一大熱點[8]。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施水楊酸處理后能夠增強本氏煙對煙草花葉病毒的系統(tǒng)性抗病性[9]。SA信號誘導(dǎo)通過增強組織細胞的活性氧(pathogenesis-related protein，PRs)清除能力和滲透調(diào)節(jié)能力，可以明顯降低白菜根腫病和冬瓜枯萎病的發(fā)病率，提高了系統(tǒng)酶活性和抗病性效果[10]。水楊酸處理還提高種胚抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸(PRO)等的含量[11]。外源JA處理能夠減輕受水稻稻瘟病病發(fā)癥狀[12]，還可以有效誘導(dǎo)辣椒對青枯病產(chǎn)生抗性，抗病效應(yīng)與體內(nèi)丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)以及抗氧化酶活性有關(guān)[13]。【本研究切入點】前人研究表明，SA、JA信號通過激發(fā)植物體防御機制的建立來參與植物生長發(fā)育調(diào)控和對外界刺激的響應(yīng)[14]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過間接、連續(xù)和混合方式噴施5 mmol·L-1濃度的 SA、1 mmol·L-1的 JA處理“熱引1號”胡椒試驗苗，在自然條件下接種辣椒疫霉菌后，通過表型鑒定、次生代謝物質(zhì)、內(nèi)源激素動態(tài)變化以及各相關(guān)防御酶活性的變化研究，闡述JA、SA在胡椒抗瘟病中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗：“以熱引1號(P.nigrumc.v.Reyin-1)”胡椒扦插苗作為材料，按照“胡椒優(yōu)良種苗培育技術(shù)規(guī)程(DB46/T 262012)”進行育苗，于沙床上培育生根后轉(zhuǎn)移至育苗盆中，每盆2棵苗，培育3～5個月。

供試菌種：辣椒疫霉菌，采用PDA培養(yǎng)基，于全氣候箱中恒溫(26～28 ℃)培養(yǎng)5～7 d，多次轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，以保證菌種活性。供試苗和供試菌種均由海南香料飲料研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 選取健康、長勢一致的胡椒苗，按照處理方式分為JA1、JA2、SA1、SA2、JA/SA1、JA/SA2、CK1、CK2 組，每組至少3株苗。CK1、CK2組為對照，用蒸餾水噴施，具體處理如下。SA1組：使用濃度為5 mmol·L-1SA處理，連續(xù)處理15 d；SA2組：間隔2 d 噴施5 mmol·L-1的SA；JA1組：單獨噴施1 mmol·L-1的JA，連續(xù)處理15 d；JA2組：間隔2 d 噴施1 mmol·L-1的JA；JA/SA1組：5 mmol·L-1的SA和1 mmol·L-1的JA混合后，連續(xù)處理15 d；JA/SA2組：5 mmol·L-1的SA和1 mmol·L-1的JA混合后，間隔2 d噴施；CK1組：連續(xù)噴蒸餾水15 d；CK2組：間隔2 d噴施蒸餾水。

觀察JA、SA噴施處理胡椒苗的生長發(fā)育狀態(tài)以及室內(nèi)接種病原菌后的變化情況，通過表型鑒定，對抗病效果顯著的處理進行重復(fù)實驗。距離采樣時間第0、12、24、72和144小時等5個時間點，于早上8：00時接種處理，用浸濕的棉花包裹，以保證病原菌的存活和侵染。用液氮存儲，采集 5個接種時間點試驗樣品，包括根、莖和葉片，用樣品袋分裝、標記編號、處理方式及接種時間，置于-80 ℃超低溫冰箱，同時每個處理隨機采取葉齡相似的5～10片葉片，趁鮮取回處理，用于測定電導(dǎo)率。剩余葉片分組置于烘箱，57 ℃恒溫烘干至恒重打粉。

1.2.2 表型鑒定 采樣：每組各采集5～10片葉，用樣品袋分裝好，并做好標記。接種：將取回來的葉片整齊擺放到消毒滅菌盤子里，葉片正面朝上，用一次性注射器針頭在葉片中央(避開葉脈)刺3個小孔，用打孔器在培養(yǎng)基上取菌絲塊，用接種針將生長有菌絲的一面覆蓋住小孔，接種在針刺孔處。盤子按照采樣標記寫上編號，于4個對角分別放上用蒸餾水浸濕的棉花團，用大號采樣袋套住，封口，保證濕度。觀察：接種第1天起開始觀察，每隔1 d觀察1次，記錄好觀察情況，并用卡尺測量葉面壞死區(qū)病斑直徑大小，按照相關(guān)胡椒瘟病抗性評價標準，對各個處理病斑進行級劃分[8]。

1.2.3 生理生化指標測定 內(nèi)源激素測定(雙抗體夾心法測定)：制備SA、JA、JA/SA和CK噴施前、噴施后(接種前)和接種后3個時間段的葉片樣品，按照試劑盒方法進行樣品稀釋及保存，并多功能用酶標儀測量450 nm波長下各個處理組葉片組織樣品OD值，并描點繪制曲線計算樣品中植物茉莉酸(JA)的濃度。水楊酸(SA)和植物乙烯(ETH)的測定方法與上述相同、相關(guān)試劑盒由上海泛柯實業(yè)有限公司提供。

次生代謝物質(zhì)：測定胡椒葉片(干重)粉末中總黃酮、總多酚及多糖含量變化，按鄒文靜等植物總黃酮、多酚及多糖的含量測定方法[15]、采用75%乙醇溶劑浸提，建立樣品與吸光度值A(chǔ)之間標準線性關(guān)系、測定含量。

防御酶PAL和PPO活性：PAL和PPO催化產(chǎn)物在290和420 nm處有特征吸收光值，分別測定290和420 nm處的吸光值變化，計算相對酶活。相關(guān)試劑盒由南京建成生物科技、上海泛柯實業(yè)有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用立體顯微鏡Stemi 2000-C、相機Canon EOS 5D Mark IV觀察和采集實驗圖片，SPSS 2017軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，采用Duncan新復(fù)極差法，比較差異及顯著性，OriginPro 2017軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源JA、SA連續(xù)處理20 d胡椒苗的變化

由圖1可知，5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA混合噴施，連續(xù)處理20 d，噴施5 mmol·L-1SA和JA/SA幼嫩的莖葉均出現(xiàn)不同程度受損。

2.2 接種病原菌前后表型變化

2.2.1 JA、SA接種病原菌發(fā)病前后的葉片變化 從圖2可以看出，對照組CK1、CK2最先在48 h發(fā)病，SA1、SA2和JA1在72 h出現(xiàn)病斑、JA2發(fā)病時間最晚，96 h出現(xiàn)病斑。96 h，所有處理組葉片均表現(xiàn)出瘟病病斑(表1)。

表1 接種胡椒瘟病病原菌的葉片情況

120 h時，CK1組和CK2組病菌沿著葉脈蔓延至葉緣，整個葉片出現(xiàn)黑色水質(zhì)狀病斑，顯微鏡下可在氣孔保衛(wèi)細胞中央看到白色菌絲附著；與接種后96 h比較，SA1組、JA1組水質(zhì)狀病斑面積不斷擴大，所有葉片顏色逐漸變暗，失去綠色光澤(圖2)。

2.2.2 接種病原菌后發(fā)病情況 由表2可知，JA/SA2組、JA2組病斑相對面積分別為12.50%和15.13%，病情級數(shù)均為1級；SA2組、JA/SA1組、SA1組和 JA1組病斑相對面積分別為26.27%、32.18%、33.11%、35.60%，病情級數(shù)均為2級。而CK1和CK2則達到了4級病情，病斑相對面積分別為78.34%、76.60%，顯著高于各處理組。綜合表型、發(fā)病情況以及經(jīng)濟效益，JA組、SA組和JA/SA組間隔2 d為比較優(yōu)良的處理方式，SA2組、SA2組和JA/SA2組為最優(yōu)處理。

表2 JA、SA接種病原菌后96 h、120 h病斑變化

2.3 JA、SA間隔處理前后內(nèi)源JA、SA和ETH含量變化

JA2、SA2處理前后胡椒葉片內(nèi)源JA、SA和ETH含量都發(fā)生了不同趨勢的變化。內(nèi)源JA含量變化：由圖3-A可知，JA2組、SA2組和JA/SA2組外源劑處理前，葉片內(nèi)源JA含量維持在1600 pmol·L-1水平；處理后(即接種前)CK2組無明顯變化，JA2組、SA2組和JA/SA2組處理均使內(nèi)源JA有所增加；接種病原菌后，JA2組內(nèi)源JA含量達到了最高水平，SA2組含量次之，JA/SA2組與接種前相比無明顯變化，接種后CK2組內(nèi)源激素也出現(xiàn)少量增加。

由圖3-B可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2外源處理前，葉片內(nèi)水楊酸含量維持在2700 pmol·L-1水平；處理后(即接種前)，CK2組和SA2組葉片內(nèi)源水楊酸含量與處理前變化程度小，無明顯差異，JA/SA2組、JA2組內(nèi)源水楊酸含量與處理前相比升高。接種后SA2組葉片內(nèi)源水楊酸含量達最高水平，JA2組次之，CK2組變化幅度相對較小。內(nèi)源乙烯ETH含量變化：由圖3-C可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2外源處理前，葉片內(nèi)源ETH含量維持在42 ng·L-1水平。JA2組、JA/SA2組的內(nèi)源乙烯ETH含量達到了84和104 ng·L-1水平，SA2組和CK2組與處理前無太大變化；接種后JA2組、JA/SA2組內(nèi)源乙烯ETH含量達最高水平為150和160 ng·L-1，SA2組與CK2組內(nèi)源乙烯ETH含量達70和90 ng·L-1。

2.4 接種病菌后總黃酮、總多酚和多糖含量變化

從圖4-A可看出，接種后JA2、SA2、CK2和JA/SA2處理總黃酮含量呈現(xiàn)升高后降低變化，CK接種后第12小時總黃酮含量最高，24、72和144 h出現(xiàn)降低趨勢，并且降低較快；JA2、SA2和JA/SA2處理總黃酮含量在24 h達到最高，在72、144 h總黃酮含量均出現(xiàn)降低趨勢。

由圖4-B可知，JA2、SA2、CK2和JA/SA2處理后接種胡椒瘟病病菌，隨著接種時間延長，5個接種時間點所對應(yīng)的葉片多酚含量均出現(xiàn)下降情況；CK2組的總多酚含量下降幅度較為明顯，各時間點均低于JA2組、SA2組和JA/SA2組的，并于144 h達到最低；JA2組、SA2組變化趨勢一致，各接種時間點多酚含量均高于CK2組和JA/SA2組。

由圖4-C中可知，接種病菌，各處理胡椒組織葉片多糖含量均出現(xiàn)先升高后降低，在24 h多糖含量為最高，而24 h后多糖含量出現(xiàn)下降趨勢；CK2組在第12～144小時均呈降低趨勢。各接種時間點多糖含量以JA2組最高，SA2組次之，CK2組最低。

2.5 接種病原菌后PAL、PPO活性以及膜質(zhì)過氧化程度

接種后，JA2、JA/SA2、SA2以及CK2組外源處理胡椒葉片組織內(nèi)PAL活性變化總體先升高后降低趨勢(圖5-A)，24 h胡椒葉片組織內(nèi)PAL活力CK2組最高，且其活力變化程度較小，JA2組、SA2組變化趨勢相當，是CK2組的1.85倍，JA/SA2組活力是CK2組的1.42倍；在第24～144小時后，各處理活力均出現(xiàn)下降。

由圖5-B可知，胡椒葉片組織內(nèi) PPO活性在SA2、JA2和JA/SA2中保持較高活性，接種病原菌后，出現(xiàn)先升高趨勢；SA2組、JA2組和JA/SA2組變化趨勢一致，在72 h SA2組達到最高，是CK2組的1.31倍，JA2組是CK2組的1.2倍，JA/SA2組是CK2組的1.1倍，72 h后降低。而CK2組在24 h的PPO活性達到最高，隨后降低。

3 討 論

水楊酸和茉莉酸在病原菌入侵過程中扮演著不可或缺的角色[16]，研究結(jié)果表明，噴施5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA 混合處理“熱引1號胡椒”后，可以有效抑制胡椒瘟病病斑面積擴大，同時不同的處理時間會有不同的效果，具體來說間隔處理方式比連續(xù)處理方式對辣椒疫霉菌的抑制力更強。鄒志燕等[17]在水稻，金夏紅等[18-19]在小麥、煙草上的研究也有相同結(jié)果。推測可能是外源JA、SA激活胡椒植株體內(nèi)產(chǎn)生抗病信號，這些抗性信號提高防御酶活性，從而使得胡椒產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。

當JA和SA同時噴施時，胡椒瘟病抗性生理生化效果明顯弱于單獨噴施JA或SA，與曹寧[20]結(jié)果相符，這表明SA、JA在介導(dǎo)胡椒抗胡椒瘟病的過程中可能也存在相互拮抗作用，但是SA與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)往往不是孤立的，存在交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還存在著與濃度有關(guān)的協(xié)同或拮抗作用[21]；JA、SA和JA/SA處理后均使胡椒葉片內(nèi)源JA、SA有所增加，對照組無明顯變化，但接種病原菌后葉片內(nèi)源JA、SA、ETH含量達到了最高水平，胡椒苗葉片內(nèi)源JA、SA含量中單獨噴施JA或SA比JA/SA混合噴施的高，JA和JA/SA混合噴施處理后可以明顯提高胡椒葉片內(nèi)源ETH的含量。在甜瓜和水稻的研究中，魯秀梅、徐以華等[22]也發(fā)現(xiàn)接種病菌后植株體內(nèi)源激素JA、SA和ETH含量均顯著增加，可能是胡椒在遭到病原菌侵染和外源誘導(dǎo)劑刺激，使得苯丙氨酸解氨酶(PAL)、腺苷酸合成酶(ATP)等酶活性發(fā)生變化，解除了對轉(zhuǎn)錄因子的抑制[23-24]，促進胡椒內(nèi)源JA和SA大量合成。有研究表明內(nèi)源JA伴隨著乙烯(ETH)的變化而發(fā)生變化，ETH與JA存在協(xié)作交互作用，而SA含量與JA和ETH沒有緊密聯(lián)系[25]。此外，乙烯既是一種與茉莉酸具有協(xié)同作用的抗病信號分子，也可以作為毒力因子致使植物感病，茉莉酸與乙烯信號途徑共同調(diào)控植保素的合成[26]。

對各處理組接種胡椒瘟病病原菌后，胡椒葉片組織內(nèi)PAL活性變化情況總體表現(xiàn)為先升高后降低趨勢，PPO也先升高后又降低；而CK處理各接種時間點PAL活力明顯低于其它3個處理。這與紋枯病毒素侵染水稻和冬瓜枯萎病防治等研究中表現(xiàn)相似[27]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)在植物抗病、生理代謝等過程中不可或缺，是水楊酸途徑中的限速酶，也是苯丙烷類代謝過程的關(guān)鍵酶，并參與黃酮、多酚等抗菌物質(zhì)的合成[28-29]；研究表明接種病原菌后，胡椒葉片組織內(nèi)PPO活性在SA、JA和JA/SA中依然保持較高活性，接種病原菌后，出現(xiàn)先升高后降低趨勢，胡椒葉片組織多酚含量在0～144 h中均出現(xiàn)降低，CK下降速度較快，胡椒葉片內(nèi)多酚的降低與PPO多酚氧化酶關(guān)系密切，可能是PPO參與了胡椒葉片中多酚的催化氧化，產(chǎn)生對病原菌有毒害作用的醌類等物質(zhì)，并參與機體中木質(zhì)素的合成，增加細胞結(jié)構(gòu)木質(zhì)化程度，從而有效抑制病原物的擴展[28]。

4 結(jié) 論

5 mmol·L-1SA、1 mmol·L-1JA和JA/SA 混合處理“熱引1號胡椒”后，可以抑制胡椒瘟病病斑面積擴大。JA、SA抗病信號傳導(dǎo)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在眾多的高植物中表現(xiàn)出相似性，可能JA、SA在這些植物中存在相同的調(diào)節(jié)信號。而JA、SA信號中存在的拮抗或協(xié)同效果與其相對濃度有關(guān)，如果對拮抗點和協(xié)同點進行人為調(diào)控，挖掘抗病相關(guān)基因，可為抗病機理、創(chuàng)新種質(zhì)資源及遺傳育種奠定基礎(chǔ)，研究作物中JA、SA的作用在農(nóng)業(yè)上具有重要意義。