1株海洋草酸青霉HY181-2的分離鑒定及其對金線蓮莖腐病病原菌的生防能力

林文珍，郭遲鳴，郭 鶯，林志楷，陳 菲，劉黎卿

(1.福建省亞熱帶植物研究所，福建 廈門 361006；2.福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006)

【研究意義】金線蓮(Anoectochilus)為多年生珍稀草本植物，坊間又叫金線草、金絲草，廣泛分布于福建、浙江、臺灣等東南沿海省(區)及云南、貴州等西南地區[1]。金線蓮不僅具有觀賞價值，例如：盆栽，組盆種植等；還是珍貴中草藥，具有極高的藥用價值。金線蓮喜陰，其生長對環境和土壤的要求較高，故生長較為緩慢，繁殖能力較低，在自然環境中分部雖然廣但不集中[2]。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，民眾對養生保健愈發重視，導致野生金線蓮私采濫挖現象屢禁不鮮[3]。自20世紀80年代初起，我國就開展了對金線蓮的人工栽培技術、藥理活性等方面的研究[3-6]。目前市面所售的金線蓮產品大部分為人工種植，包括大棚栽培和仿野生林下種植。隨著金線蓮人工種植產業的擴大，其內在隱患也漸漸顯露。金線蓮野生資源的萎縮和現有品種的老化[7]，莖腐病、灰霉病等土傳病害不斷蔓延，都嚴重制約著金線蓮產業的發展，其中莖腐病已成為金線蓮人工種植的重要病害之一。金線蓮莖腐病的致病菌株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，是一種土傳的微生物菌害，在人工栽培金線蓮的所有階段都可能被其侵染。特別是在組培苗轉移至大棚和林下栽培初期，植株抗病能力較弱，幼苗如發生莖腐病，極易出現大面積倒伏、死亡現象[8]。莖腐病與軟腐病發病初期極為相似，大多由植株莖基部開始發病[9]，病斑黃褐色呈水漬狀，5～7 d病斑迅速蔓延至莖周，病發莖組織腐爛干枯后塌縮呈線狀；葉片呈現黑黃干卷曲狀。該病傳染力強、爆發率高的特性嚴重影響著福建乃至全國金線蓮產業的發展，影響產品品質的同時也打擊了廣大種植戶的積極性。因此，加強對莖腐病等金線蓮常見病害的防治研究，不僅能帶來經濟效益，更能一定程度上解決民生需求。【前人研究進展】目前對金線蓮病害防治的研究，較多集中在化學殺菌劑的混合噴施以及病害的分離鑒定上[8, 10-11]。化學防治是防治金線蓮病害的重要手段之一，但化學農殘所帶來的食品安全和生態安全問題也日益加重[12]。國內關于金線蓮莖腐病病害防治的最新文獻為卓飛等[13]對海南省金線蓮種植中主要病蟲害防治的研究，其中針對莖腐病提出的防治措施主要是發病前期使用戊唑醇乳油、腈菌唑可濕性粉劑和多菌靈等化學殺菌劑對土壤噴施。截止目前對金線蓮莖腐病的生物防治相關研究較少，張淑芬等[14]利用木霉屬AHS06菌株制成的生防菌劑對金線蓮莖腐病開展了生物防治試驗，蔡金池等[15]發現TA菌株的發酵液對金線蓮莖腐病具有較好的防治效果。為應對國外日益高筑技術壁壘的新形勢，不控制農藥殘留，將無法適應出口要求，因而活體微生物農藥是生物防治的物質基礎和重要手段。【本研究切入點】本試驗對福建東山珊瑚自然保護區珊瑚樣本進行處理時分離到一株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2。通過平板對峙初篩試驗，發現其對金線蓮莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)JXL具有拮抗作用。為進一步驗證HY181-2除菌落生長的競爭性作用之外，其次級代謝產物是否也具有抑菌功能，對HY181-2進行了小量發酵試驗，獲得發酵萃取物。通過氣相色譜-質譜分析發酵萃取物組分，并利用菌絲生長速率法，分別測定海洋來源真菌草酸青霉(P.oxalicum)HY181-2發酵萃取物和4種化學殺菌劑對金線蓮尖孢鐮刀菌的室內毒力測定。【擬解決的關鍵問題】當前國內的農用微生物制劑還較少，國內外的微生物制品都存在著作用單一、抑菌譜窄、性價比不高等問題，且多數制品的功能活性物質來自陸源微生物。故開發新的安全、低毒、高效、無殘留、無污染的海洋來源微生物制劑，具有廣泛的應用前景。本研究結果為開發防治金線蓮莖腐病的微生物制劑提供了理論與技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試培養基與主要試劑 查氏培養基、YM培養基、PDB培養基、PDA培養基、淘米水培養基(取淘米水用8層紗布過濾，滅菌備用)、玉米培養基(200 g玉米碎，加水煮30 min后，紗布過濾，取濾液用蒸餾水補足至1000 mL滅菌備用)；乙酸乙酯、二甲基亞砜(DMSO)、甲醇等。

1.1.2 供試菌源 供試金線蓮莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)JXL,由福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室從廈門、漳州和龍巖等地金線蓮種植基地采集的金線蓮莖腐病病株中分離、純化并保存。海洋來源草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2，由自然資源部第三海洋研究所徐煒博士提供的福建東山珊瑚自然保護區珊瑚樣本中分離、純化和培養獲得。菌株保存和活化均使用PDA培養基。

1.1.3 供試殺菌劑 海洋來源草酸青霉(P.oxalicum)HY181-2發酵萃取物(福建東山珊瑚自然保護區珊瑚樣本)、25%吡唑醚菌酯(山東康喬生物科技有限公司)、50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇三山農藥有限公司)、10%苯醚甲環唑(中國農科院植保所廊坊農藥中試廠)、80%代森錳鋅可濕性粉劑(山東省濟南一農化工有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株的分離與純化 將自然資源部第三海洋研究所徐煒博士提供的福建東山珊瑚自然保護區珊瑚樣本在無菌超凈臺敲碎，分別放入查氏培養基、YM培養基、PDB培養基、淘米水培養基和玉米培養基中，28 ℃搖瓶培養1～2 d。取發酵液分別在各自對應的培養基平板上以10倍梯度稀釋涂板，并置于28 ℃恒溫箱中培養5～7 d，每天觀察生長情況并挑取單菌落進行純化。篩選過程中發現一株具有潛在抑菌作用的真菌，分布在其菌落四周的其他菌株的菌落，大多呈現出一定的受抑菌現象。本實驗室即對該真菌進行多次純化，并將獲得的菌株命為HY181-2。

1.2.2 供試菌株的鑒定 菌株HY181-2形態學鑒定：將純化后的菌株HY181-2接種至PDA培養基，28 ℃恒溫、避光培養4～5 d，觀察菌落特征。

菌株HY181-2分子生物學鑒定：，采用Fungal DNA Kit 的方法提取菌株HY181-2的菌絲體DNA,擴增ITS序列[16]，將擴增產物由上海捷瑞生物工程有限公司測序。測序結果通過NCBI進行BLAST比對分析，并從NCBI上下載同源性較高的堿基序列，用軟件MEGA6進行系統發育樹的構建，以明確菌株HY181-2的分類地位。

1.2.3 菌株HY181-2對菌株JXL的拮抗作用 將菌株HY181-2和JXL分別接種至PDA平板，28 ℃恒、避光培養4～5 d，選取菌落邊緣的菌塊。將菌株JXL菌塊置于平板中央，在其兩邊對稱位置分別放置菌株HY181-2菌塊和空白培養基塊。28 ℃恒溫箱中避光培養，直至菌株JXL菌絲生長至培養皿邊緣，每個處理設3個重復。

1.2.4 菌株HY181-2小量發酵并獲取發酵液萃取物 將菌株HY181-2接種至PDA培養基中活化培養2～3 d，從菌落邊緣挑取菌絲接種至PDB培養基，28 ℃、160 r/min避光振蕩培養7 d后，分離菌體獲得發酵液。加入與發酵液等體積的乙酸乙酯，充分振蕩后靜置。待乙酸乙酯與發酵液完全分層后，取有機相溶液通過EYELA的旋轉蒸發儀去除多余的乙酸乙酯，旋蒸瓶內所得的即為菌株HY181-2發酵液萃取物。

用10 mL左右的甲醇對旋蒸瓶內的萃取物進行復溶，并輔助以超聲溶解。將獲得的萃取物置于離心機中，4 ℃、20 000 r/min離心10～15 min，去除不溶物。將上清液EP管中，45 ℃、1000 r/min濃縮2 h。計算菌株HY181-2發酵液萃取物的重量。可根據試驗需要用二甲基亞砜(DMSO)或甲醇對萃取物再次復溶，配置成濃度為100 mg/mL的母液，冷藏或冷凍備用。

1.2.5 菌株HY181-2發酵液萃取物氣相色譜—質譜分析 用甲醇對菌株HY181-2發酵液萃取物再次復溶，配置成濃度為20 mg/mL的母液，4 ℃、20 000 r/min離心30 min，取上清去除不溶物用于氣相色譜-質譜分析。

GC-MS條件。色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚)。載氣為高純氦氣，99.999%。進樣口溫度：250 ℃。分流進樣，分流比5∶1。色譜-質譜接口溫度：280 ℃。離子源溫度：230 ℃。離子化方式：EI。電子能量：70 eV。掃描范圍：40～500 amu。程序升溫參數：60 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至210 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升到310 ℃，保持15 min。

1.2.6 供試殺菌劑母液配制 用二甲基亞砜(DMSO)將HY181-2發酵萃取物稀釋成所需系列質量濃度的10倍母液，用無菌超純水將其他殺菌劑稀釋成所需系列質量濃度10倍的母液，各殺菌劑母液濃度梯度為各殺菌劑有效成分的濃度梯度。依據前期預試驗結果，設定各個殺菌劑濃度梯度。HY181-2發酵萃取物濃度梯度設定為0.1、1、10、50、100 mg/L，25%吡唑醚菌酯濃度梯度設定為0.1、1、10、50、100 mg/L，50%多菌靈可濕性粉劑濃度梯度設定為1、10、50、100、1000 mg/L，10%苯醚甲環唑濃度梯度設定為0.1、1、10、50、100 mg/L，80%代森錳鋅可濕性粉劑濃度梯度設定為1、10、50、100、1000 mg/L。

1.2.7 梯度培養基的配制 按照設定的濃度梯度，將各殺菌劑母液以1∶9的比例加入融化的PDA培養基中，混合均勻后倒入9 cm培養皿，即為配制所需質量濃度的含毒培養基。同時將不含HY181-2發酵萃取物的DMSO也以1∶9的比例加入融化的PDA培養基中，作為含HY181-2發酵萃取物的含毒培養基的陰性對照，并以不含殺菌劑的PDA培養基作空白對照(CK)。

1.2.8 室內毒力測定方法 采用菌絲生長速率法測定[17]，將尖孢鐮刀菌接種至空白PDA培養皿中，26 ℃培養5 d。使用打孔器選取菌齡一致的菌餅(直徑7 mm)，并接種于含毒培養皿、陰性對照培養皿和空白對照PDA培養皿中央，每個處理做3次重復，26 ℃恒溫倒置培養5 d。5 d后取出，應用十字交叉法[18]測量每個培養基的菌落直徑，將測得的各菌落直徑減去原菌餅直徑(7 mm)，得出最終菌落純生長直徑，用于計算供試殺菌劑每個處理對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率。

菌絲生長平均抑制率(%)=[空白(CK)對照純生長直徑-試驗處理組純生長直徑]/空白(CK)對照純生長直徑×100

運用Microsoft Excel 求出抑制率機率值(y)與濃度對數(x)之間的毒力回歸方程、每種殺菌劑的抑制中濃度EC50[17]及相關系數(r)[19]。

2 結果與分析

2.1 菌株HY181-2的鑒定

2.1.1 菌株HY181-2的形態特征鑒定 菌株HY181-2菌落整體較為平坦(圖1-a、圖1-b)，菌落中間有明顯的突起小環，菌落呈地毯式蔓延生長，菌落周邊有一圈白色菌絲，質地絨狀，菌落中間呈青綠色，而白色與青綠色交界處的菌絲呈現出淡黃綠色。HY181-2菌絲初期為白色，后淺黃至淺綠最后至青綠色，表面呈密氈狀，產生大量分生孢子，且分生孢子極易飛揚；菌落反面呈淡黃色，周邊無明顯色素產生。

菌株HY181-2分生孢子梗有分隔(圖1-c)，具有帚狀枝小梗，帚狀枝通常雙輪生，偶有三輪生或單輪生；孢子常為鏈狀生長，多為球形，表面光滑；孢子形成后淺黃至淺綠最后至青綠色。

根據在PDA上生長的菌落形態和顯微鏡鏡檢結果，結合參照《中國真菌志》[20]和《真菌鑒定手冊》[21]，菌株HY181-2符合青霉屬的生長特性，初步確認該菌為青霉屬(Penicillium)真菌。

2.1.2 菌株HY181-2的分子鑒定 用通用引物ITS4和ITS5對菌株HY181-2的DNA序列進行擴增，測得堿基序列(圖2)。

將菌株HY181-2的ITS序列在NCBI中進行BLAST 比對，HY181-2與已發表的相關青霉屬(Penicilliumsp.)菌株的序列同源性為100%。利用軟件MEGA6構建以青霉屬rDNA-ITS 序列為基礎的系統發育樹(圖3)，菌株HY181-2與草酸青霉(Penicilliumoxalicum，HM053477.1)的進化距離最近。

結合形態學鑒定結果，最終將菌株HY181-2鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。菌株HY181-2已于2020年8月14日由廣東省微生物菌種保藏中心收到，并登記入冊。保藏號：GDMCC No:61142。

2.2 菌株HY181-2對尖孢鐮刀菌JXL的菌絲抑制作用

生防菌指利用有益微生物殺滅或壓低病原生物數量以控制或預防植物病害發生、發展的一類措施。

其生防功能特點主要包括兩個方面，一是生長速度快，包括菌絲、菌體生長速度快和產孢能力強，能在短時間內迅速占領生長空間，與病原菌進行營養競爭；二是其獨特的具有殺滅或是抑制病原微生物生長的次級代謝產物。

將HY181-2菌塊接種在PDA平板上，28 ℃避光恒溫培養7 d，菌落直徑可達5 cm，產孢能力極強，3 d內HY181-2菌塊上白色菌絲迅速產生大量分生孢子，并且孢子極易脫落，輕微振動可遠距離傳播，并迅速扎根生長，說明菌株HY181-2具有生防菌生長快的特點。結合試驗前期粗篩結果，將菌株HY181-2與病原菌JXL進行平板對峙試驗，進一步研究其生防能力。

平板對峙試驗表明，菌株HY181-2對病原菌JXL具有較強的抑制作用(圖4-a、圖4-b)，呈現出明顯的抑菌圈。病原菌JXL菌落被抑制的部分呈紫紅色，對菌絲進行鏡檢(圖4-c)，發現被抑制部分的菌絲與未被抑制部分的菌絲有較大的區別，被抑制部分的菌絲提前進入成熟、老化階段，產生大量的分生孢子。表明，菌株HY181-2對病原菌JXL具有拮抗作用，具有開發成生防菌的潛力。

2.3 菌株HY181-2發酵液萃取物的氣相色譜—質譜分析

為驗證菌株HY181-2的次級代謝產物是否具有抑菌能力，將菌株HY181-2進行小量發酵，每升發酵液當中獲得259 mg的萃取物。將發酵液萃取物溶液進行氣相色譜—質譜分析(圖5)。

表1 5種殺菌劑對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果

表2 5種殺菌劑對尖孢鐮刀菌的室內毒力回歸方程

通過GC-MS研究發現，HY181-2的發酵萃取物中主要包括脂肪酸類(圖5-峰1，圖5-峰2，圖5-峰3)、蒽醌類(圖5-峰4)、甾體類(圖5-峰5，圖5-峰6，圖5-峰7，圖5-峰8，圖5-峰9)等多種成分，這些次級代謝產物具有抗氧化、抑菌、抑制體外腫瘤細胞生長、抑制酶活性等作用[22-24]。

2.4 室內毒力測定

為更直觀地了解菌株HY181-2次級代謝產物的抑菌能力，進行了室內毒力測定。由表1～2可知，菌株HY181-2發酵萃取物與其他4種殺菌劑對金線蓮莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌JXL均有抑制作用。但病原菌菌絲對不同的殺菌劑敏感度差異較大，而DMSO對菌絲生長的抑制率僅為1.1%，幾乎可以忽略。10%苯醚甲環唑的抑菌效果最好，EC50值為0.16 mg/L，且對菌絲生長的抑制較為敏感，濃度僅為0.1 mg/L時，抑制率就已達44.66%。HY181-2發酵萃取物和25%吡唑醚菌酯的抑菌效果次之，EC50值分別為2.72和2.02 mg/L；但吡唑醚菌酯隨著濃度的升高，對菌絲生長的抑制效果提高的并不明顯，濃度從0.1 mg/L升至100 mg/L，抑制率僅提高了14.96%。80%代森錳鋅可濕性粉劑的EC50為244.02 mg/L；相比之下50%多菌靈可濕性粉劑的抑制效果最差，金線蓮莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌對80%代森錳鋅可濕性粉劑的敏感度最低，其EC50值高達2794.24 mg/L。

3 討 論

致病性尖孢鐮刀菌是種世界性的土傳真菌病害之一，可侵染多種作物[25]。本研究表明金線蓮莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌，與趙云青等[8]的結果一致。傳統的化學農藥是防治病蟲害的重要而有效的手段之一，但生物防治是一條更為理想和環保的途徑。抑菌實驗結果表明菌株HY181-2及其次級代謝產物對尖孢鐮刀菌JXL具有良好的抑制作用，也表明HY181-2的次級代謝產物中具有抑菌活性物質，與馬新玥等[26]的結果一致。本研究中GC-MS結果發現HY181-2的次級代謝產物具有抗氧化、抑菌、抑制體外腫瘤細胞生長、抑制酶活性等多種作用，這與王培樂等[27]關于海源草酸青霉活性產物的獨特性與多樣性的研究結果一致。本研究所選取的4種抑菌劑均屬于低毒高效的廣譜抑菌劑。室內毒力測定結果表明，菌株HY181-2發酵萃取物和4種化學殺菌劑，對尖孢鐮刀菌JXL均有抑制作用。雖然在同一濃度的情況下，相較于共試4種化學殺菌劑而言，菌株HY181-2發酵萃取物對菌株JXL菌絲的抑制作用不是最佳的。但隨著濃度的升高，菌株HY181-2發酵萃取物對菌株JXL菌絲的抑制效果依然十分顯著，當濃度為100 mg/L時，抑制率高達85.03%。而在此濃度下25%吡唑醚菌酯的抑制率為57.76%，50%多菌靈可濕性粉劑的抑制率為40.06%，10%苯醚甲環唑的抑制率為94.97%，80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑制率為48.94%。以毒力指數為指標，菌株HY181-2發酵萃取物在此次室內毒力測定試驗中效果僅次于10%苯醚甲環唑。但菌株HY181-2發酵萃取物為微生物生長代謝所得，相較于化學殺菌劑而言，來源安全、健康、無農殘，并且可以隨著微生物的生長源源不斷的獲取。若將HY181-2開發成相應的微生物制劑應用于實際生產，不僅可以減少化學農藥的使用量和使用頻率，進一步減低農殘，還可以減少種植戶的生產成本。

金線蓮整個生長周期均有可能感染莖腐病，且該病病勢迅猛，極易在短期內出現大面積倒伏[8]。除在莖腐病發病時使用生物和化學抑菌劑進行補救外，提高田間管理水平和力度也十分重要[3]。該研究的藥劑篩選只反映出了生防菌HY181-2和4種化學藥劑的室內效果，田間的實際使用效果以及混合施用效果等問題還有待進一步研究。同時，有研究表明[28]，不同的藥劑劑型對防治的效果也有影響。因此，研究合適的生防菌劑型同樣具有重要意義。

4 結 論

從福建東山珊瑚自然保護區珊瑚樣本中分離得到的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)HY181-2對金線蓮莖腐病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)JXL具有較強的抑制作用。小量發酵獲得萃取物的結果顯示其發酵液當中的次級代謝產物產量能達到259 mg/L。菌株HY181-2同時具有生防菌所具備的生長速度快和代謝活性產物的特點，后期可開發利用的潛力較大。室內毒力測定結果表明菌株HY181-2次級代謝產物在相同濃度條件下有著不弱于常規化學殺菌劑的抑菌能力。菌株HY181-2具有開發成防治金線蓮莖腐病的生物農藥的價值和潛力，并且其所具有的生長快和代謝活性產物的雙重特性表明，菌株HY181-2可用于不同劑型的研制。