早勝牛UCP3和FOXO1基因多態性與生長發育的聚合分析

周 力，李雪清,2，孫永剛，高占紅，桂林生*

(1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

【研究意義】作為線粒體內膜中陰離子載體的一個亞組，解偶聯蛋白家族(uncoupling proteins, UCPs)主要通過轉運線粒體外膜中的質子，抑制Adenosine Triphosphate(ATP)和 Reactive oxygen(ROS)的產生，進而參與機體的能量代謝進程[1]。該家族包括7個成員，分別為UCP1，UCP2，UCP3，UCP4，BMCP1，StUCP和AtUCP。其中，UCP3主要定位于骨骼肌線粒體中，同時在脂肪及心臟的線粒體中也存在一定量的表達[2]。【前人研究進展】研究證實，UCP3能夠轉運脂肪酸、脂質過氧化物和丙酮酸等，調控脂肪酸儲存水平及細胞抗氧化能力。在小鼠骨骼肌中過表達UCP3后，能夠顯著提高小鼠的運動量及能量消耗，同時大幅減少氧化應激[3]。相較于正常的小鼠，過表達UCP3的小鼠在飼喂高脂日糧后表現出更好的葡萄糖耐受性以及更少的睪脂沉積[4]。相反，特異性敲除肌肉組織中的UCP3基因，小鼠的體重升高同時其肝臟中糖原貯存能力增強[5]。轉錄因子Forkhead box O 1(FOXO1)定位于細胞核中，也被稱為FKHR，屬于叉頭轉錄因子家族的FOXO亞家族，在葡萄糖轉運和脂肪代謝過程中扮演重要的角色。肥胖患者內臟脂肪組織中FOXO1表達量顯著高于正常個體[6]。FOXO1能夠通過與HMGA1相互作用，調控與胰島素代謝密切相關基因的轉錄水平，從而維持肝臟中葡萄糖代謝平衡[7]。作為傳統中藥成分，葛根芩連湯能夠促進HepG2細胞中Silent Information Regulator 1(SIRT1)的表達，并下調FOXO1的表達水平，最終調控小鼠體內甘油三酸酯，血糖及胰島素水平[8]。雌性動物體內的雌激素(Estrogen)可以通過激活ERα-PI3K-Akt信號通路來抑制FOXO1的表達水平，進而降低小鼠體內的葡萄糖異生作用[9]。此外，1,25二羥基維生素D3通過降低成骨細胞中FOXO1的表達，阻止FOXO1向細胞核內轉移，抑制高糖環境下成骨細胞的異常增殖和凋亡，最終改善成骨細胞的代謝[10]。類似的，白藜蘆醇能夠通過負調控sirt1/FOXO1通路，緩解高糖對成骨細胞分化的抑制作用[11]?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于UCP3和FOXO1與生物機體中糖脂代謝緊密關聯，筆者推測這些基因可能會直接或間接影響動物的生長發育。【擬解決的關鍵問題】本研究以UCP3和FOXO1為研究目標，檢測其單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisins，SNPs)及合并基因型對早勝牛生長發育的影響，以期為早勝牛分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在同等飼養條件下，隨機選擇24～36月齡健康的早勝牛419頭，采樣地點為甘肅省慶陽，所有個體于清晨空腹采集頸靜脈樣本，置于抗凝采血管中，-20 ℃保存備用。所有試驗牛無親緣關系。為減少采樣次數及采樣季節等因素對結果造成的誤差，本試驗樣品采集于2019年7月，一次性采集樣品。同時，記錄樣本個體的體重、體斜長、體高、胸圍等生長發育指標。采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)提取血液DNA，然后使用NanoDrop 2000分光光度計檢測DNA的濃度及純度，確保樣品DNA濃度大于50 ng/L，OD206/OD208處于1.8～2.0。

1.2 UCP3和FOXO1基因PCR擴增

根據 GenBank 公布的牛UCP3序列(AC-000172.1)和FOXO1的序列(AC-000169.1), 利用 Primer 5.0軟件設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司負責合成。引物信息詳見表1。

表1 引物序列信息

PCR反應體系30.0 μL，包括Mix混合液(天根，北京)15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上游、下游引物各(10 pmol/μL)0.6 μL、DNA(50 ng/μL)2.0 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

1.3 突變位點檢測

分別從每種PCR產物中隨機選取8個樣本進行混合并構建DNA池，送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果使用DNAMAN軟件進行對比分析，尋找突變位點。

1.4 統計分析

采用在線軟件(http://www.msrcall.com/Gdicall.aspx)計算基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量(polymorphism information content, PIC)，并進行Hard-Weinberg平衡適應性檢驗。使用SPSS(13.0 version)軟件中一般線性模型方法(General linear models)分別對UCP3和FOXO1的突變位點基因型與早勝牛生長發育指標進行相關性分析，整個樣本群體的年齡劃分為4個階段，分別為24～27月齡，28～30月齡，31～33月齡和34～36月齡。計算模型中基因型及年齡設定為固定效應。

2 結果與分析

2.1 UCP3和FOXO1基因型分析

牛UCP3位于第15號染色體上，基因全長10 520 bp，含6個外顯子，5個內含子(圖2)。通過測序分析發現，UCP3存在3個SNP位點，分別是定位于第2內含子上的g.4439G>A，第3外顯子上的g.4899G>A和第4內含子上的g.5575G>A。其中，g.4439G>A位點僅存在GG和GA兩種基因型，可能與樣本的采集規模相關。牛FOXO1位于第12號染色體上，基因全長93 786 bp，含3個外顯子，2個內含子(圖3)。該基因3’側翼區檢測到1個SNP，命名為g.92209C >T。

由于本試驗中檢測到的4個突變位點均沒有合適的限制性內切酶，故本試驗采用DNA直接測序法進行基因型分型。表2顯示了這4個突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量以及Hardy Weinberg 平衡狀態。結果顯示，UCP3的3個突變位點，GG均為優勢基因型，且G是優勢等位基因；FOXO1的g.92209C >T上，CC為優勢基因型，T為優勢基等位因?？ǚ綑z驗表明，這兩個基因上的4個突變位點都處于Hardy Weinberg平衡狀態(P>0.05)。此外，g.4439G>A和g.4899G>A處于低度多態水平(PIC<0.25)，而g.5575G>A和g.92209C >T則處于高度多態水平(PIC> 0.25)。

表2 群體遺傳結構分析

2.2 UCP3和FOXO1不同基因型對早勝牛生長發育的影響

關聯性分析結果(表3)顯示，UCP3上的g.5575G>A位點不同基因型顯著影響體重和胸圍，GG基因型的體重均值極顯著高于AA型(P<0.01)，GG基因型的胸圍均值顯著高于AA型(P<0.05)。FOXO1上的g.92209C>T位點上的CC基因型生長發育性狀表現最優，體重方面，CC基因型極顯著高于TT基因型(P<0.01)；胸圍方面，CC基因型個體的胸圍顯著大于TT基因型(P<0.05)。

表3 UCP3和FOXO1不同基因型對早勝牛生長發育性狀的影響

2.3 UCP3和FOXO1基因合并基因型對早勝牛生長發育性狀的影響

2個基因中4個位點存在5種發生頻率高于5.00%合并基因型。表4顯示，GG-GG-GG-CC發生頻率最高，達到21.00%，其次為GG-GG-GG-CT和GG-GG-GA-CC，頻率分別為17.18%和9.54%。利用合并基因型方差分析模型分析不同合并基因型對早勝牛生長發育性狀的影響，表5結果顯示，合并基因型GG-GG-GG-CT個體的體重極顯著高于GG-GA-GA-CC個合并基因型(P<0.01)，但在體斜長、體高和胸圍方面，合并基因型各組之間差異不顯著(P>0.01)。因此，在本試驗群體中，GG-GG-GG-CT在早勝牛體重方面可被視為一種最為優秀的合并基因型。

表4 早勝牛UCP3和FOXO1合并基因型分布情況

表5 UCP3-FOXO1合并基因型對早勝牛生長發育性狀的影響

3 討 論

作為世界上黃牛品種數最多的國家，中國現有黃牛品種53個，其中以秦川牛、南陽牛、魯西牛、晉南牛和延邊牛5大品種最具代表[12]。早勝牛主要分布于甘肅省，是甘肅省主要的黃牛種質資源，具有耐粗飼，抗逆性強等特點，同時也存在中國黃牛品種普遍具有的缺點，如生長發育緩慢，后驅欠發達。目前，針對早勝牛的分子輔助標記選育的研究比較少。因此，本研究選擇兩個與糖脂代謝緊密關聯的候選基因，首次探究這些基因的多態性與早勝牛生長發育相關性狀的關聯性。盡管目前在其它黃牛品種中已有相關研究，但SNP突變的發生及其發生頻率受到諸多因素的影響，如品種、年齡、飲食和環境均可能引起基因發生堿基突變，這意味著同一品種黃牛生活環境或者飼喂管理的不同都可能造成其基因堿基突變差異化。在前人的研究基礎之上，本研究選擇年齡和飼喂管理相似的早勝牛，檢測在甘肅省早勝牛特定生活環境下，與其生長發育性狀緊密關聯的UCP3和FOXO1 SNP位點。

UCP3廣泛存在于哺乳動物的各個組織器官中，在基因表達、轉錄調控及翻譯后修飾等多個水平上維持機體能量平衡[13]。在小鼠和人上研究證實，禁食、低碳水化合物飲食、高飲食以及急性運動均能夠誘導骨骼肌中的UCP3表達水平提高，同時伴隨血漿脂肪酸水平顯著升高，說明UCP3在滿足機體對脂肪酸氧化需求方面發揮重要的作用[14-16]。目前，UCP3在畜禽方面的功能研究較少，通過軟件預測發現關嶺牛UCP3啟動子區域呈現高度保守性，可能MZF1、GATA以及C/EBP等關鍵轉錄因子結合[17]。飼喂白藜蘆醇后發現，杜長大豬脂肪中UCP3表達水平顯著升高，證實UCP3能夠促進脂肪酸氧化，進而減少脂肪沉積[18]。前期試驗證實，在秦川牛UCP3的第3外顯子上檢測到2個突變位點，分別命名為g.4877G>A和g.4902C>T，其中g.4902C>T能夠顯著影響秦川牛的體高和胸圍[19]。通過PCR-SSCP分型法發現，g.5465G>A和g.8162T>C的不同基因型與中國寧夏地區西門塔爾雜交牛的體重、體斜長、胸圍等生長發育指標緊密相關[20]。本研究在419頭早勝牛群體中檢測發現，UCP3存在3個突變位點，分別為g.4439G>A，g.4899G>A和g.5575G>A，關聯性結果顯示，外顯子突變g.4899G>A的GG基因型個體體重和胸圍顯著高于AA基因型個體，而其余2個突變位點不同基因型個體之間的生長發育性狀差異不顯著，可能是因為這2個突變位點均定位于UCP3的內含子上，并不能改變氨基酸結構。

轉錄因子FOXO1是FoxO家族中發現最早的成員，在細胞分化信號通路與轉錄級聯反應中發揮著重要作用[21]。在人和小鼠上，關于FOXO1的研究主要集中在癌癥發生、胰島素抗性及肥胖治療等[22-23]。畜牧方面，以研究FOXO1對肉質的調控機制為主。在羊、豬和牛等動物上均證實FOXO1能夠通過去磷酸化作用，能夠抑制脂肪細胞和肌細胞的增殖及分化，進而影響肉品質[24-25]。牛的FOXO1主要在肝臟、肺臟以及脾臟中表達，肌肉中的FOXO1在犢牛期的時候表達量最高，成年牛時明顯下降[26]。目前，關于牛FOXO1多態性研究不多，只有在秦川牛上有相關報道。前期，秦川牛FOXO1上檢測到5個突變位點，4個定位于外顯子，1個定位于3’側翼區，關聯性分析揭示了3’側翼區的突變位點與體斜長、胸圍和胸深等方面密切關聯[27]。本試驗同樣在FOXO1的3’ 側翼區發現1個多態位點(g.92209C>T)，發現這個突變位點均對早勝牛生長發育性狀有一定的影響，CC基因型為優勢基因型，能夠顯著提高早勝牛的體重和胸圍。盡管該突變位點定位于3’側翼區，不能改變氨基酸結構，但研究證實，3’側翼區能夠與miRNA結合，發生突變可能會影響到miRNA的結合效率，導致基因的表達受到調控[28]。后期，我們計劃對該突變位點的功能進行相關研究。

基因聚合分析是分子育種中一個重要的途徑，目前該方法在植物分子育種中應用廣泛，由于動物繁殖周期過長、成本過大等因素制約，基因聚合育種在動物方面，尤其是反芻動物上進展緩慢[29]。李國輝等[31]在白耳雞上發現，GH、POU1F1以及PRL3個基因的聚合基因型對產蛋性能具有顯著的影響，遺傳效應高于單個基因的基因型[30]。在中國美利奴羊上，MC4R和PROP1的合并基因型顯著影響生長發育性狀。An 等[32]在山羊GNRH1和GDF9上檢測到3個突變位點，發現合并基因型A1G1G2G2A3A顯著與不同胎次母羊繁殖力緊密關聯。以上研究均證實，基因聚合育種在動物上應用并推廣是切實可行的，更有利于畜禽的遺傳改良。

本研究通過合并UCP3和FOXO1發現，合并基因型各組之間的體重和胸圍之間差異明顯(P<0.05或P<0.01)，合并基因型GG-GG-GG-CT個體的生長發育，尤其是體重和胸圍均值表現最佳。通過比較發現，兩個基因的聯合效應要大于單基因對早勝牛生長發育的效應。盡管UCP3和FOXO1定位于不同的染色體，但研究發現脂肪細胞中的FOXO1可以與轉錄因子Tfeb結合，通過自噬作用，進而調控UCP基因家族的表達水平[33]。這一研究從側邊印證本研究的結果，UCP3和FOXO1的聚合基因型遺傳效果顯著高于單個基因的基因型的遺傳效果。

4 結 論

本研究發現，突變位點g.4899G>A(UCP3)和g.92209C>T(FOXO1)與早勝牛體重和胸圍顯著關聯。UCP3和FOXO1基因的優勢合并基因型為GG-GG-GG-CT，其個體的體重和胸圍顯著或顯著高于其它合并基因型，可以嘗試將UCP3和FOXO1作為影響早勝牛生長性狀的候選基因用于標記輔助選擇，為其選育工作提供科學依據。