奶牛產后血液生化指標變化規律研究

郭啟勇，吳心華，陶金忠，郭延生*

(1.寧夏大學農學院動物科學技術系，寧夏 銀川 750021；2.隴南市動物衛生監督所，甘肅 隴南 746000)

【研究意義】奶牛圍產期(Periparturient Period)是指產前21 d和產后21 d[1]。在規模化、集約化的生產模式下，圍產期奶牛的營養代謝病和產后感染發病率不斷升高[2]。奶牛在圍產期普遍存在能量負平衡(Negative energy balance，NEB)[3]，主要原因是圍產前期胎兒的迅速生長和激素變化導致干物質(Dry matter intake，DMI)下降，奶牛分娩結束后，則迅速進入產奶狀態，由于產犢應激，DMI不能盡快恢復，日糧中的能量不能滿足產奶需要和維持需要[4]。NEB導致奶牛血糖降低，血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸(BHBA)濃度升高，使得奶牛圍產期NEB加劇[5]。高濃度的NEFA與BHBA使血液中性粒細胞產生免疫抑制，增加了奶牛對外界病原微生物的易感性。奶牛圍產期完成了從妊娠狀態到分娩再到產后恢復以及從初乳形成到啟動泌乳再到大量泌乳等關鍵變化。我國乳業飛速發展，規模化、集約化牧場成為優質乳品提供者，提高單產和降低發病率成為規模化牧場的管理目標。【前人研究進展】圍產期的各種代謝變化和疾病的發生都是互相關聯的，產后2周內是疾病的高發階段，也是容易淘汰的階段。奶牛產后子宮炎的發病率大約20%，胎衣不下的發病率15%～25%[6-7]，免疫抑制影響奶牛的正常代謝，加劇代謝性疾病的發生。血液是家畜機體物質交換和運輸的載體，血液生理生化指標能夠準確的反應家畜機體營養物質代謝水平、健康狀況和生產性能。【本研究切入點】通過對奶牛產后0、7、14和21 d的血液中肝功、脂代謝等相關指標進行檢測，對產后奶牛的生理生化指標及生產性能動態變化規律進行了系統性的研究。【擬解決的關鍵問題】揭示奶牛產后生理生化動態規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物飼養管理 試驗動物均為荷斯坦奶牛，牛只飼喂和樣品采集均于2019年9—11月在寧夏某養殖場進行。選取產奶量與體況相近的2～3胎次的產后荷斯坦奶牛10頭。奶牛場每天擠奶3次(4:00，12:00，20:00)。采用全混合日糧(TMR)飼喂，自由飲水，產前用表1配方飼喂，產后用表2配方飼喂。產后1 h內將益康XP 350 g、丙酸鈣450 g、硫酸鎂100 g、鹽50 g、丙二醇300 mL、氯化鈣120 g、溫水20 L混合經瘤胃液導管灌服。

1.1.2 樣品采集 在分娩后0、7、14、21 d早上飼喂前尾靜脈采集血液10 mL，肝素鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，收集血漿，-196 ℃保存。

1.1.3 主要儀器 超低溫冰箱(DW-HL388，中科美菱低溫科技股份有限公司)；Varioskan FlasF全波長多功能酶標儀(Thermo，美國)；邁瑞獸用全自動生化分析儀(BS-180，深圳邁瑞公司)，血酮檢測儀(Abbott Diabetes，墨西哥)；血糖檢測儀(雅培，美國)；離心機(TGL-16，江蘇中大儀器科技有限公司)；移液槍(Eppendorf，所有規格)等。

1.2 試驗方法

血樣常溫下解凍，應用邁瑞獸用全自動生化分析儀對血漿中AST(IFCC法)、ALP(AMP-緩沖液法)、GGT(γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法)、ALT(連續監測法)、TP(雙縮脲法)、ALB(溴甲酚綠法)、GLB、LDL-C(選擇性清除法)、HDL-C(過氧化氫酶清除法)、ApoA1(免疫比濁法)、ApoB(免疫比濁法)、NEFA(酶比色法)、TCH(酶比色法)、TG(氧化酶法)進行檢測；采用ELISA法檢測血漿中VLDL。

1.3 統計方法

2 結果與分析

2.1 奶牛產后不同階段DMI和產奶量

奶牛產后DMI在0 d顯著低于產后7、14和21 d(P<0.05)，7 d開始呈逐漸上升趨勢(P>0.05)。產奶量在0 d顯著低于產后7、14和21 d(P<0.01)，產后7 d產奶量顯著高于產后21 d(P<0.05，表1)。

表1 奶牛產后DMI和產奶性能的變化

2.2 奶牛產后肝功相關生化指標變化規律

血漿中AST、GGT在0 d顯著低于其他各時間段(P<0.05，表2)，血漿中AST在0～7 d上升顯著(P<0.05)，在14～21 d上升顯著(P<0.05)；血漿中ALP在0 d顯著高于其他各組(P<0.05)；血漿中ALT隨時間呈現緩慢上升趨勢(P>0.05)；血漿中TP在21 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中ALB個時間段差異不顯著(P>0.05)；血漿中GLB在7 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中VLDL呈逐漸下降趨勢且21 d顯著低于7 d(P<0.05)。

表2 奶牛產后肝功能相關指標測定

2.3 奶牛產后脂代謝相關生化指標變化規律

血漿中BHBA在14 d極顯著高于其他組(P<0.01，表3)；血漿LDL-C在7 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中HDL-C在0 d顯著低于其他時間段(P<0.05)，隨時間呈現上升趨勢(P>0.05)；血漿中ApoA1在14 d顯著低于其他時間點(P<0.05)；血漿中ApoB在0 d顯著低于其他時間段(P<0.01)；血漿中NEFA 在14 d極顯著低于其他時間段(P<0.01)；血漿中TCH在14 d顯著高于其他各時間段(P<0.05)，在7 d具有上升趨勢(P> 0.05)；血漿TG、GLu在0 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中GLu在7 d開始有緩慢上升趨勢(P>0.05)。

表3 奶牛產后脂代謝相關指標測定

3 討 論

3.1 奶牛產后血糖變化規律

血漿中GLu濃度作為評價機體代謝最為普遍的標準，通過血漿中GLu濃度反應糖代謝水平[8]，血漿中GLu是通過糖異生維持。GLu在機體中的代謝由神經內分泌激素調控，常見的有胰島素、胰高血糖素、腎上腺素、糖皮質激素、生長激素等。在本次研究中，產后0 d的血糖水平極顯著于其他各時間段。在生產應激作用下，GLu迅速升高。這與之前的研究一致[9]。在圍產期，奶牛存在低血糖。奶牛血漿中GLu低于2.8 mmol/L在臨床上判定為低血糖[10]。隨著采食量的不斷提高，奶牛的血漿中GLu在產后14 d逐漸恢復，在圍產前期奶牛需要大量的GLu供給來滿足胎兒的營養需要[11]。奶牛產后產奶性能的恢復和DMI不能迅速提高而導致的低血糖。在圍產后期，乳腺需要大量的GLu來合成乳汁，造成嚴重NEB。GLu降低還會影響肝臟清除極低密度脂蛋白的能力，極低密度脂蛋白從肝中運送受阻，TG在肝中蓄積導致奶牛的脂肪肝。

3.2 奶牛產后肝功能的代謝變化

肝臟是反芻動物極為重要的代謝器官，各種酶含量豐富，體內多種生理生化反應必須在肝臟的參與下才可以完成。圍產期肝臟的代謝活躍。臨床上通常使用AST、ALT、ALP和GGT來評價肝臟的功能和代謝狀況[12]。ALT 和AST主要反應肝實質的損害，ALT主要存在于肝細胞中，在血漿中相對較少，1%肝細胞死亡，則血清中的酶活性增加1倍，AST、GGT產后0 d顯著低于產后7、14和21 d，產后血漿中AST的濃度在不斷增加，產后癱瘓、酮病、乳房炎都可以檢測到AST濃度升高[13]，AST的濃度升高與疾病有關。當肝細胞受損時，血液中的ALT和AST的濃度增高。研究顯示當奶牛血漿中AST>100 U/L，奶牛存在發生脂肪肝的風險[14]。GGT主要存在于家畜的腎臟及奶牛乳腺中，GGT存在于腺體上皮，其活性可能與氨基酸代謝強度有關[15]。奶牛產后，血漿中GGT的濃度隨之升高，肝臟的代謝紊亂會加劇血液中GGT濃度的升高。說明奶牛產后存在肝臟損傷，有患脂肪肝的風險。

圍產期奶牛蛋白質的變化規律可以通過分析TP、ALB的濃度來確定。TP和ALB反應蛋白質的缺乏與代謝。奶牛體內ALB在肝臟內合成，ALB降低說明肝臟合成蛋白的能力下降，TP主要反應肝臟對營養物質的分解和儲備能力，有研究表明，TP的正常含量是(65.85±15.82)g/L，白蛋白(24.53±4.27)g/L[16]。本研究中，血漿中TP在產后21 d顯著高于其他時間段，與奶牛泌乳期一致，在產后逐漸升高，說明泌乳需求的啟動和DMI的逐漸恢復，使得血漿中的TP逐漸增高。VLDL在肝臟由TG和TCH合成，本研究中，TG在產后0 d顯著高于其他時間段，說明產犢初期奶牛PRL的濃度升高，PRL濃度的升高則會抑制脂蛋白連接酶的活性，促使體內TG濃度增加。從肝臟釋放的富含甘油三酯的VLDL轉化為富含TCH的低密度脂蛋白，由全身特定的細胞膜受體分解代謝。奶牛肝臟脂肪主要以VLDL形式轉運出肝臟[17]，本研究中，產后0 d顯著高于其他時間段，說明奶牛產后0 d肝臟脂肪輸送能力優于產后21 d。有研究顯示，高產奶牛的VLDL濃度高于低產奶牛，高產奶牛在熱應激條件下，血漿中VLDL的濃度為(0.76±0.04)mmol/L[18]，這與產后21 d血漿中的VLDL一致，說明奶牛在圍產后期的脂肪肝與肝臟輸送TG的能力有關。

3.3 奶牛產后脂質代謝變化

脂質不溶于血漿，并且無法遞送到腎上腺、性腺等組織。圍產后期，奶牛由于產奶需要，對乳脂、乳糖的需求急速上升，對日糧中葡萄糖的需求也增多[19]。圍產期奶牛DMI下降，使葡萄糖不能滿足奶牛生產需要，此時就會發生脂肪動員，脂肪動員釋放大量的NEFA進入血液及肝臟，引起營養代謝病。奶牛在產后1個月內，約有5%～10%的奶牛患有重度脂肪肝，30%～40%的奶牛患有中度脂肪肝，脂肪肝除了導致產奶量下降，還會提高其他感染性疾病的發病率[20]。體脂代謝產生大量NEFA可以作為β-氧化的能量燃料。高濃度的NEFA會損傷細胞線粒體的功能，降低ATP的產量[21]。對不能進行β-氧化的組織(例如神經元組織)，肝臟產生BHBA替代葡萄糖為機體供能。盡管BHBA和NEFA是重要的代謝能源，但高濃度的BHBA和NEFA會導致代謝障礙，增加酮病和脂肪肝的發病風險[22]。由于NEFA升高導致肝臟脂肪變性，引起VLDL的合成減少，導致NEFA濃度在產后0 d顯著高于其他時間。肝臟中過量的NEFA沒有被及時清除，蓄積之后生成BHBA[23]。根據本研究表示，奶牛產后14 d血漿中BHBA顯著高于其他時間段，存在患酮病的風險，BHBA值的升高與采食量的下降也有關系，奶牛的采食量在產后14 d并沒有恢復。能量負平衡導致機體進行脂肪動員，機體需要分解大量的NEFA為機體提供能量[24]。當機體無法全部利用NEFA時，就會引發酮病。過量的NEFA進入線粒體β-氧化或重新脂化生成TG，TG蓄積在肝臟，與膽固醇脂、磷脂和ApoB形成極低密度脂蛋白，極低密度脂蛋白進入血液循環之后會形成低密度脂蛋白[25]。

NEFA在脂酰輔酶A合成酶的作用下轉化為脂酰輔酶A，代謝分為三個途徑，一是徹底氧化成CO2所產生的能量被肝臟利用，二是部分生成BHBA，被肝臟之外的組織利用；三是脂化成甘油三酯、磷脂和膽固醇脂，轉移到乳腺，合成乳脂[26]，反芻動物生成甘油三酯的脂肪酸主要來自于血液中的NEFA。肝臟中的甘油三酯可以通過極低密度脂蛋白轉移出肝臟，為外周組織所利用。反芻動物體內缺乏脂蛋白脂酶和肝脂酶[27]。奶牛產后0 d血漿中TG顯著高于其他時間段，說明奶牛肝臟中蓄積大量的TG，與圍產前期飼喂偏胖有關，奶牛干奶期間肥胖加劇了奶牛產后低血糖的發生和產后DMI的降低。奶牛產后由于體脂動員和內分泌機能的改變，DMI下降使乳腺需要的營養得不到滿足，從而導致脂肪的動員，血液中的NEFA濃度急劇增加，并通過血液進入其他組織，從而加重奶牛的NEB。

ApoA1是HDL-C的主要結構蛋白，ApoB是LDL-C的主要結構蛋白，ApoB是肝臟中VLDL組裝所必需的，作用于LDL受體的配體可用于從血液中清除LDL顆粒，有助于從腸道吸收膳食脂肪，為肝臟中VLDL組裝所必需，并且還充當LDL受體藥物從血液中清除LDL顆粒的主要配體。載脂蛋白B的主要功能是參與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的組裝和分泌，是脂蛋白和特異性受體的主要連接物[28]。奶牛產后7 d血漿中HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB顯著高于其他時間段，可能是因為產后7 d泌乳機能啟動導致。泌乳機能的啟動會導致血漿中HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB濃度升高，可能與產后灌服丙二醇有關[29]，說明圍產期奶牛的脂肪代謝紊亂會導致肝臟運輸障礙，從而導致代謝性疾病的多發。脂蛋白運輸發生障礙，會蓄積在肝臟，影響肝臟的正常代謝功能。BHBA蓄積會導致體脂代謝謝異常，但NEFA濃度已經降低，說明產后奶牛肝臟對物質的代謝和轉化能力沒有恢復，仍然處于嚴重的NEB狀態。

4 結 論

隨著產后14 d干物質采食量的逐漸恢復，血糖開始逐漸正常。奶牛產后處于能量負平衡階段，肝臟和脂肪代謝發生異常，從而導致各種代謝性和感染性疾病的發生。