POT1-AS1在胃腺癌組織中的表達及其對細胞增殖的影響

賀海斌 張智勇 趙偉

胃腺癌（gastric adenocarcinoma,GAC）是常見的惡性腫瘤之一[1]，目前最有效的治療方法是手術治療，但部分患者在診斷時已處于晚期，失去最佳手術治療時機，且預后較差[2]。因此，探索GAC發生、發展的分子機制，尋找新的早期診斷及治療靶點是目前GAC研究的重點[3-4]。長期以來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一種不編碼蛋白質、長度＞200個核苷酸的RNA，廣泛分布在基因組中。目前認為lncRNA是基因組調節機制的重要組成部分[5]。也有證據表明，某些lncRNA在癌癥中失調，并在表觀遺傳調控、基因轉錄調控以及其他與腫瘤發生、侵襲有關的生物學過程中發揮重要作用[6]。近年來，lncRNA在胃腸道癌癥發生、發展中的分子機制是研究熱點[7]。POT1-AS1是一種lncRNA，其在GAC中的表達譜和潛在機制目前尚未知曉。因此，本研究對POT1-AS1在GAC組織中的表達及其對細胞增殖的影響作一探討，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2016年6月至2018年12月在西安交通大學第一附屬醫院普通外科手術切除的80對GAC組織及其癌旁正常組織標本，立即存于多聚甲醛溶液中；所有患者術前未接受過放、化療等輔助治療。所有入組患者簽署知情同意書。正常人胃黏膜上皮細胞GES-1和 GAC 細胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901均購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。本實驗經西安交通大學第一附屬醫院和寧波市醫療中心李惠利醫院醫學倫理委員會審查通過。

1.2 細胞培養及轉染 將正常人胃黏膜上皮細胞GES-1和 GAC 細胞株 BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901置于 37℃、5% CO2的培養箱中，用含 10% FBS的DMEM培養基（批號：SH30022.01，美國HyClone公司）培養。當細胞生長至約60%融合度時，按照Effectene Transfection Reagent（批號：301425，德國 Qiagen 公司）說明書步驟將sh-POT1-AS1質粒轉染至SGC-7901細胞中，即POT1-AS1敲低。

1.3 組織及細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量檢測 采用RT-qPCR法。Trizol法提取GAC組織及其癌旁正常組織和 GAC細胞系 GES-1、BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901中的RNA，按照RNA逆轉錄試劑盒（美國Thermo Scientific公司）說明書步驟將RNA逆轉錄為cDNA，按照qPCR試劑盒（瑞士Roche公司）說明書步驟進行PCR。PCR條件：95℃10 min預變性，95℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸循環40次；引物序列正義為GGCCATTACCCCTCCACTTG，反義為 TGTTGGGTATGCACCTCCAC。采用2-ΔΔCt法計算 POT1-AS1 mRNA相對表達量。

1.4 GAC細胞增殖能力檢測 （1）采用CCK-8試驗。將SGC-7901細胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）以2 000個/孔的密度接種在96孔板中，在恒溫培養箱中培養 0、24、48、72 h，然后每孔加入 10 μl CCK-8 試劑（批號：CX001M，上海雅酶生物科技有限公司），37℃孵育1 h，使用酶標儀（美國Molecular Devices公司）檢測450 nm處的吸光度（OD450）。（2）采用平板克隆試驗。將SGC-7901細胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）以1 000個/孔的密度接種在6孔板中，在恒溫培養箱中培養14 d，然后用甲醛溶液固定，結晶紫染色，相機拍照并計數。

1.5 細胞周期相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。使用RIPA裂解液提取SGC-7901細胞（包括POT1-AS1敲低組、未敲低組）蛋白樣品，使用BCA定量試劑盒（批號：P0010，上海碧云天生物技術有限公司）檢測蛋白樣品濃度。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（美國BIORAD公司）將蛋白樣品分離后轉至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉后用一抗和相應的二抗孵育。最后用ECL發光液（批號：WBLUF0500，美國Millipore公司）顯影，應用Image J軟件（美國NIH公司）進行Western blot圖片條帶灰度值分析，蛋白相對表達量=（轉染組蛋白條帶灰度值/轉染組內參條帶灰度值）/（未轉染組目的蛋白條帶灰度值/未轉染組內參條帶灰度值）。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKI1A）等抗體均購自英國Abcam公司，批號分別為ab134175、ab108357、ab109520；β-actin 抗體購自美國Proteintech公司，批號為66009-1-Ig。

1.6 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GAC組織與癌旁正常組織中POT1-AS1 mRNA相對表達量比較 80例GAC患者CAC組織中POT1-AS1 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 1。

圖1 GAC組織與癌旁正常組織中POT1-AS1 mRNA相對表達量比較（GAC為胃腺癌）

2.2 GAC細胞系與正常人胃黏膜上皮細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量比較 GAC細胞系BGC-823、MGC-803、MKN45、SGC-7901 中 POT1-AS1 mRNA 相對表達量均明顯高于正常人胃黏膜上皮細胞GES-1，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 GAC細胞系與正常人胃黏膜上皮細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量比較（GAC為胃腺癌；與GES-1比較，*P＜0.05）

2.4 sh-POT1-AS1質粒轉染對SGC-7901細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量的影響 sh-POT1-AS1質粒轉染后，SGC-7901細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量明顯低于未轉染組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 sh-POT1-AS1質粒轉染對SGC-7901細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量的影響（與未轉染組比較，*P＜0.05）

2.5 POT1-AS1敲低對SGC-7901細胞增殖能力的影響 CCK-8試驗結果顯示，POT1-AS1敲低組SGC-7901細胞增殖能力明顯低于未敲低組，差異有統計學意義（P＜0.05）；采用平板克隆試驗作進一步驗證，結果顯示POT1-AS1敲低組SGC-7901細胞克隆數明顯少于未敲低組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 POT1-AS1敲低對SGC-7901細胞增殖能力的影響（a：CCK-8試驗結果；b：平板克隆試驗結果；與未敲低組比較，*P＜0.05；OD450為450nm處的吸光度）

2.6 POT1-AS1敲低對SGC-7901細胞中細胞周期相關蛋白相對表達量的影響 POT1-AS1敲低后，SGC-7901細胞中Cyclin D1、CDK4蛋白相對表達量較未敲低組明顯降低，而CDKI1A蛋白相對表達量較未敲低組明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖5。提示POT1-AS1促進GAC細胞周期進展。

圖5 POT1-AS1敲低對SGC-7901細胞中細胞周期相關蛋白相對表達量的影響（Cyclin D1為細胞周期蛋白D1；CDK4為細胞周期蛋白依賴性激酶4；CDKI1A為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A；β-actin為β-肌動蛋白；與未敲低組比較，*P＜0.05）

3 討論

GAC是我國常見、多發的惡性腫瘤，復發和轉移是其預后不良的重要原因。早期診斷并及時治療能有效改善GAC患者的預后，提高遠期生存率。因此，進一步探索GAC發病的分子機制、診斷和治療分子靶點是目前GAC研究的重點。lncRNA作為一種廣泛存在的非編碼RNA，參與調控細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[8]。研究表明，lncRNA在GAC發生、發展中起重要作用，如IGF2-AS通過吸附miR-503調節SHOX2，從而影響GAC轉移[9]；LIFR-AS1通過miR-29a-3p/COL1A2促進胃癌細胞增殖和侵襲[10]；LINC01667通過miR-138-5p/Cyclin E1影響胃癌增殖[11]；LINC00641通過miR-582-5p啟動自噬，從而影響GAC細胞對奧沙利鉑的耐藥性[12]；RPLP0P2促進胃癌細胞增殖[13]。目前關于POT1-AS1在GAC中的表達與功能尚無相關研究，故本研究作了相關探索，結果發現POT1-AS1在GAC組織及細胞系中呈高表達。經sh-POT1-AS1質粒轉染（即POT1-AS1敲低）后，SGC-7901細胞中POT1-AS1 mRNA相對表達量明顯低于未轉染組，差異有統計學意義。然后經CCK-8試驗和平板克隆試驗證實POT1-AS1可抑制GAC細胞增殖能力。進一步探尋POT1-AS1抑制GAC細胞增殖能力的機制，結果發現在GAC細胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表達并促進CDKI1A蛋白表達，進而阻礙細胞周期進展，抑制細胞增殖。

綜上所述，GAC組織及細胞系中POT1-AS1 mRNA相對表達量均明顯升高；在GAC細胞中敲低POT1-AS1可抑制CDK4、Cyclin D1蛋白表達并促進CDKI1A蛋白表達，進而抑制細胞增殖。筆者認為POT1-AS1可作為新的GAC分子標志物或治療GAC潛在的分子靶點，具有重要的臨床意義。