ABCG2基因多態性與小兒急性淋巴細胞白血病大劑量甲氨蝶呤化療效果及毒性反應的關系

王華 應勤來 劉曉琳 王天驕 朱佳聰 滕懿群

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是兒童常見腫瘤之一。甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）作為大多數化療方案中抗癌劑的核心，在ALL臨床治療上取得了明顯療效，但大劑量MTX在提高治愈率的同時，也不可避免地產生消化道黏膜損害、血液毒性、肝腎損害等毒性反應。研究表明，MTX血藥濃度與臨床療效、毒性反應關系密切，但不同個體間化療效果及毒性反應差異很大且原因復雜[1-3]，其中基因多態性是重要原因之一，主要為編碼MTX膜轉運蛋白基因的序列差異[4-5]。MTX的外向轉運蛋白是ABC亞家族G成員2（ABC subfamily G member 2,ABCG2）[6]，ABCG2 基因編碼的P-糖蛋白在多種組織中既可以作為功能屏障，又可以作為外排轉運蛋白，其過度表達可導致多藥耐藥，并影響多種抗癌藥物的藥代動力學。研究表明，ABCG2基因中的變體可改變P-糖蛋白的表達和功能[7]。盡管MTX不被視為P-糖蛋白底物，但是MTX單藥治療的研究表明，沉默的ABCG2基因多態性可能影響MTX化療效果和毒性反應[8]。目前關于ABCG2單核苷酸多態性在ALL患兒中影響的臨床研究較少，故本研究對ABCG2基因多態性與ALL患兒大劑量MTX化療效果及毒性反應的關系作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2018年12月嘉興市第二醫院新診斷的167例ALL患兒為研究對象，男80例，女 87 例；年齡 1～18[4.9（1.1，11.3）]歲；免疫表型：B細胞140例，T細胞21例，雙表型2例，未表型4例；診斷時 WBC＜50×109/L 78例，≥50×109/L 89例；染色體≥50條101例，＜50條66例；大劑量MTX化療后首次緩解133例，發生事件34例；融合基因檢測結果：BCR-ABL1（+）12 例，TEL-AML1（+）4 例，E2A/PBX1（+）11 例，MLL-AF4（+）5 例。入組標準：（1）ALL 的診斷符合兒童ALL診療建議（第三次修訂草案）中相關標準[9]；（2）DNA 樣本和臨床數據具備可用性；（3）均接受 CCLG-2008 方案治療；（4）無唐氏綜合征；（5）既往無惡性腫瘤史；（6）在化療鞏固治療前無肝腎功能不全或受損。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過，所有患兒或家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 化療方法 根據患兒年齡、WBC、免疫表型、細胞遺傳學和分子畸變、強的松不良反應、誘導治療結束時的形態學緩解（基于BFM風險標準）、治療結束時的微小殘留病變情況綜合評估，標準風險（SR）69例，中間風險（IR）98例。參照CCLG-2008誘導治療方案和鞏固治療方案進行治療[10]。在化療鞏固階段（第8、22、36、50天），患兒每2周接受1次大劑量MTX化療。大劑量MTX給藥方式如下：總劑量的10%在0.5 h內通過靜脈輸注給予，剩余的90%在23.5 h內給予（SR、IR患兒的MTX劑量分別為2、5 g/m2）。在大劑量MTX輸注開始后42、48和54 h，以15 mg/m2的劑量進行甲酰四氫葉酸解救治療。48 h后的高血漿MTX濃度（＞0.25 μmol/L）作為延長解救的指示；每天檢測血漿中MTX濃度，直至低于 0.2 μmol/L。

1.2.2 基因分型 取外周血白細胞和（或）存檔的骨髓載玻片，分別使用FlexiGene試劑盒（德國Qiagen公司）、QIAamp DNA Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA。使用限制性片段長度多態性PCR基因分型方法測定 ABCG2基因rs2231137、rs2231142位點的基因型。PCR 擴增條件：初始變性（95 °C，10 min），40個變性循環（95 °C，15 s），退火（60 °C，1 min）和延伸（72 °C，1 min）和延長（72 °C，7 min）。rs2231137引物序列：正向為 5'-CCCAGAGTCCTTATTCTTAGCC-3'，反向為 5'-GTGCCTCCTTCACACACAG-3'。rs2231142 引物序列：正向為5'-TGTTGTGATGGGCACTCTGATG-3'，反向為5'-ATCAGAGTCATTTTATCCACAC-3'。擴增完成后，將限制酶HpyCH4IV加入PCR產物中并在37℃下孵育4 h，使用溴化乙錠染色的3%瓊脂糖凝膠電泳分析限制性片段長度多態性。

1.2.3 MTX血藥濃度測定 在開始輸注MTX后的第48、72 h采集患兒2 ml血液樣本，采用熒光偏振免疫分析法測定血漿MTX濃度，即MTX血藥濃度。

1.2.4 毒性反應評估 在大劑量MTX輸注結束到下一個大劑量MTX周期間隔或大劑量MTX輸注后14 d評估每個大劑量MTX周期后患兒的毒性反應，包括血液毒性、肝毒性、腎功能損傷、胃腸道毒性、口腔黏膜炎等。血液毒性定義為血清Hb、WBC、PLT降低。肝毒性定義為血清ALT、AST或γ-谷氨酰轉移酶水平升高。腎功能損傷定義為血清肌酐或尿素水平升高。胃腸道毒性定義為存在腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、腸梗阻。根據美國國家癌癥研究所常見毒性標準4.0版對毒性進行分級，選擇鞏固治療期間最高等級的毒性作為分析的終點。

1.2.5 生存評估 所有患兒中位隨訪時間75個月，記錄72個月無事件生存率（event free survival,EFS）。事件包括任何部位的疾病復發、任何原因的死亡或其他惡性腫瘤的發生等。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。對每個位點基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALL患兒ABCG2基因型分布 167例ALL患兒ABCG2的2個位點rs2231137、rs2231142基因型分布頻率見表1，經Hardy-Weinberg平衡檢驗，提示該研究人群具有代表性（均P＞0.05）。

表1 ALL患兒ABCG2的2個位點基因型分布頻率（n=167）

2.2 不同基因型患兒MTX血藥濃度比較 在rs2231137位點，GG與AG+AA基因型患兒鞏固治療期間第48、72 h時MTX血藥濃度比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在rs2231142位點，CT+TT基因型患兒鞏固治療期間第48、72 h時MTX血藥濃度均高于CC基因型患兒，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 不同基因型患兒MTX血藥濃度比較（μmol/L）

2.3 不同基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應及用藥延遲時間比較 167例ALL患兒接受大劑量MTX化療的毒性反應主要有血液毒性（80.8%）、胃腸道毒性（36.5%）、口腔黏膜炎（26.9%）、肝毒性（23.4%）、腎功能損傷（17.4%）。在rs2231137位點，GG、AG、AA基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；在rs2231142位點，CT、TT基因型患兒腎功能損傷發生率較CC基因型患兒明顯升高（P＜0.05），而其余大劑量MTX化療毒性反應各基因型比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。因化療毒性反應導致大劑量MTX鞏固治療用藥延遲≤2周154例（92.2%），＞2周13例（7.8%）；rs2231137、rs2231142位點各基因型患兒用藥延遲情況比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 3。

表3 不同基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應及用藥延遲時間比較[例（%）]

2.4 不同基因型患兒大劑量MTX化療后EFS比較 在rs2231137位點，GG與AG+AA基因型患兒72個月EFS比較[（88.5±1.7）%比（83.3±3.2）%]，差異無統計學意義（P＞0.05）；在rs2231142位點，CC與CT+TT基因型患兒72個月EFS比較[（90.2±1.8）%比（81.5±4.6）%]，差異亦無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

大劑量MTX在改善ALL的治愈率方面具有重要作用，但個體間差異也很大[5]。基因多態性是導致個體間差異的重要原因之一。在以往的研究中，涉及MTX轉運體通路的基因中有多個單核苷酸多態性參與MTX的藥代動力學和臨床效應，但結果并不明確[11-12]。因此，本研究對接受CCLG-2008方案治療的ALL患兒ABCG2基因多態性與大劑量MTX化療效果及毒性反應的相關性作一探討，結果顯示ABCG2的rs2231142位點多態性與腎功能損傷發生率升高有關。Liu等[12]研究表明，ABCG2的rs2231142位點多態性與MTX化療毒性反應無關，與本研究結果不同。目前也有其他研究分析ABCG2基因多態性與大劑量MTX化療毒性反應的關系，但結果并不一致[12-13]。這種差異的解釋可能是大劑量MTX化療后服用四氫葉酸，從而降低了大劑量MTX的毒性反應。

大劑量MTX誘導的腎功能損傷常發生在穩態血漿濃度結束時或結束后不久，其誘導腎功能損傷的可能機制如下：（1）腎小管尿液中MTX的pH依賴性沉淀；（2）來自傳入小動脈血管收縮的腎灌注減少；（3）直接小管毒性的腎小管內MTX攝取減少[14-15]。鑒于大劑量MTX誘導腎臟損傷的發生時間以及在大劑量MTX輸注前、中、后通過堿化尿液和四氫葉酸補救均能有效預防大劑量MTX誘導的腎功能損傷，目前相對認可腎小管尿液中MTX的pH依賴性沉淀導致腎毒性發生的觀點[16]。迄今為止，rs2231142多態性與大劑量MTX相關腎功能損傷機制尚未明確，不過已有研究表明TT基因型可能是大劑量MTX化療毒性反應的傾向因子[12]。本研究結果也顯示，rs2231142位點TT基因型與大劑量MTX相關腎功能損傷發生率升高相關。目前原因暫不明確，筆者查閱既往文獻發現，rs2231142位點TT、TC基因型酶的活性分別是CC基因型的70%和40%，而rs2231137位點AA基因型酶的活性僅為GG基因型的30%[10]。可見，相比于rs2231137位點變異，rs2231142位點變異使ABCG2轉運能力下降更為明顯，可導致更多的MTX留在胞外，進而形成MTX沉淀，誘發腎功能損傷。

本研究還檢測了48、72 h時MTX血藥濃度，結果發現在rs2231142位點CT+TT基因型患兒MTX血藥濃度均明顯高于CC基因型患兒。在大劑量MTX化療期間，MTX主要通過腎臟以原型排泄，足量的水化和堿化可以清除體內大部分MTX，但分布至各組織和間液中的MTX與血藥濃度達到平衡的速度很慢，且清除率低[17]，這部分MTX除通過腎臟排泄外，還需依賴于肝臟等其他代謝途徑，而肝臟代謝途徑中的轉運體OATP1B1能起到有效限制MTX清除的作用[18]。可見，ABCG2基因多態性與MTX組織分布、肝臟攝取代謝、治療效果等密切相關。因此，對于大劑量MTX化療過程中血藥濃度異常增高的患兒，當其他非基因因素不能解釋時，可以用是否存在藥物遺傳學差異來解釋，但仍需要在基因檢測與遺傳變異方面作進一步探究。

近年來，關于ABCG2基因多態性與ALL患兒生存預后關系的研究結果并不一致[12-13]。Liu等[12]發現rs2231142位點是ALL患兒生存預后的獨立影響因素。Chang等[19]研究發現rs2231142位點與136例中國ALL患兒復發風險無關。但是，上述研究結果均顯示TT+TC基因型患兒60個月EFS低于CC基因型患兒。基于這些數據，筆者推測具有rs2231142位點T等位基因的患兒可能具有更高的復發風險。本研究結果發現，TT+TC基因型患兒72個月EFS低于CC基因型患兒，但差異無統計學意義。本研究的中位隨訪時間長于上述2個研究的隨訪時間，理論上復發例數會增多，因為ALL復發往往發生在后期低風險患兒[20]。因此，目前結果可能表明ABCG2基因多態性并不能作為ALL患兒存活的有效標志物，針對rs2231142位點多態性與EFS之間的關系仍需要進一步研究明確。

綜上所述，ALL患兒ABCG2的rs2231142位點基因多態性與大劑量MTX化療毒性反應腎功能損傷相關，但與預后關系不大。但本研究也存在一定的局限性，如在MTX轉運途徑中僅選擇ABCG2基因的外向轉運蛋白進行分析，未包括其他內向和外向蛋白；樣本量有限等。