天然蛋白與酵母β-葡聚糖組合物增強免疫力功能研究①

馮學(xué)軒 王 弋 嚴(yán)家榮 饒子亮 梁秋玲 鄺少松（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣州528248）

免疫是機體至關(guān)重要的保護性生理功能，可有效地識別危險信號，抵御外來病原微生物的入侵并清除體內(nèi)有害物質(zhì)，最終維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。但免疫力一旦下降，機體的抵抗能力也將隨之降低，容易引起疾病的發(fā)生[1-2］。可見，提高免疫力對維持人體健康有著重要意義。目前，臨床上雖然有著不少的免疫增強劑可用于提高人體免疫力，但成本高，副作用大，并不適合正常人群使用，為此，本研究擬將天然活性蛋白乳清蛋白、小麥蛋白與酵母β-葡聚糖進行組合，以求開發(fā)出安全性高、可供正常人群使用的增強免疫力保健食品。

眾多研究指出，蛋白質(zhì)是維持和修復(fù)機體以及細胞生長所必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)水解為氨基酸被吸收后重新合成各種蛋白質(zhì)，這其中就包括了免疫細胞生成和抗體合成所需的蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)在體內(nèi)不能被貯存，必須水解成氨基酸后才能被利用[3-4］。因此，所攝入蛋白質(zhì)的氨基酸構(gòu)成成為了其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。乳清蛋白其主要成分為β-乳球蛋白（48%），α-乳白蛋白（19%），它們是必需氨基酸和支鏈氨基酸的良好來源，其中的必需氨基酸含量還遠高于植物性來源的蛋白質(zhì)，這些必需氨基酸參與了絕大多數(shù)免疫因子的合成，而支鏈氨基酸對于組織的生長和修復(fù)起著十分重要的作用[5-6］。小麥蛋白則富含谷氨酸和脯氨酸，能提供人體淋巴細胞所需的營養(yǎng)成分、促進免疫球蛋白分泌并調(diào)節(jié)腸內(nèi)營養(yǎng)，與乳清蛋白組合可為機體免疫反應(yīng)提供氨基酸原料，是免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，但光有物質(zhì)基礎(chǔ)并不能充分調(diào)動機體的免疫效能[7］。因此，本研究創(chuàng)新性地加入了酵母β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖具有特殊的三維結(jié)構(gòu)，能與巨噬細胞和中性粒細胞、淋巴細胞表面受體結(jié)合，影響細胞的信息傳遞過程，激活淋巴細胞的免疫活性，使其能夠快速地到達病原所在位置，是免疫反應(yīng)的助推劑，協(xié)助乳清蛋白和小麥蛋白發(fā)揮免疫增強作用[8-10］。但該組合應(yīng)用尚屬首次，其功效也未被驗證，為此本研究擬通過一系列免疫試驗驗證該組合的功效，也為其后續(xù)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的藥效學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境 5 個實驗分別采用50 只SPF 級BALB/c 小鼠，雄性，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2018-0002。動物飼養(yǎng)在SPF 級動物房。實驗動物合格證號：44007200069671、44007200070000、44007200069588、44007200069996、44007200069970，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40%～70%，采用12 h 晝夜間斷照明。動物自由進食和飲水，所有飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。 試驗倫理編號：A201910-4、 A201910-2、 A201910-6、 A201910-5、A201910-3。本試驗涉及的與動物試驗相關(guān)的內(nèi)容和程序遵從實驗動物使用和管理的相關(guān)法律法規(guī)及廣東省醫(yī)學(xué)使用動物中心實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物及主要試劑 乳清蛋白、小麥蛋白與酵母β-葡聚糖組合物：每4.2 g 組合物含酵母β-葡聚糖0.14 g，（湯臣倍健股份有限公司）；轉(zhuǎn)移因子口服溶液（批號190315，南京瑞爾醫(yī)藥有限公司）；2，4-二硝基氟苯（DNFB，批號C10266157，麥克林公司）；丙酮（批號20170202-2，廣州化學(xué)試劑廠）；橄欖油（批號C10438064，麥克林公司）；薇婷脫毛膏[批號2022011610H，利潔時家化（中國）有限公司］；氯化鈉注射液（批號G19052106-1，廣東科倫藥業(yè)有限公司）；印度墨汁（批號1126A18，雷根生物有限公司）；無水碳酸鈉（批號20180709，廣東光華科技股份有限公司）；脫纖維綿羊血（批號Y18N10D103400，源葉生物有限公司）；Triton X-100（批號84000150，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；PBS（批號94F001200，廣州鼎國科技有限公司）；Tris base（批號7626010160，Genview公司）；鹽酸（批號20170204-1，廣州化學(xué)試劑廠）；乳酸鋰（批號C10096217，麥克林公司）；硝基氯化四氮唑（INT，批號C10079977，麥克林公司）；吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS，批號71222010120，Genview 公司）；氧化型輔酶Ⅰ（NAD，批號8830010130，GENVIEW 公司）；刀豆蛋白A（Con A，批號SLBP2641V，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；MTT（批號7101K，MP 公司）；異丙醇（批號20190303，廣東光華科技股份有限公司）。

1.1.3 主要儀器 JEA3001型電子天平（感量0.1 g，上海浦春計量儀器有限公司）；BSA224S型電子天平（感量0.1 mg，德國Sartorius 公司）；Multiskan GO 型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；GHG-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州凈化有限公司）；熒光倒置相差顯微鏡（型號CKX41，日本奧林巴斯公司）；CCL-170B-8CO2 培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）。

1.2 方法 將小鼠隨機分為陰性對照組、陽性對照組、組合物低、中、高劑量組，10只/組，共5組。分組后，陽性對照組灌胃轉(zhuǎn)移因子口服液原液，組合物低、中、高劑量組分別按0.7、1.4、2.1 g/kg的劑量灌胃受試物溶液，陰性對照組動物灌胃溶媒（0.5%CMC-Na溶液），灌胃體積20 ml/kg，1次/d，連續(xù)30 d，末次給藥后進行下列各項試驗。

1.2.1 小鼠淋巴細胞增殖的影響試驗 給藥30 d后各組動物安樂死后無菌取脾，將脾置于200 目篩網(wǎng)上并浸于無菌Hank's 液中，輕輕研磨并制成單細胞懸液，1000 r/min，離心10 min，沉淀細胞經(jīng)紅細胞裂解液裂解紅細胞后，RPMI1640 完全培養(yǎng)液重懸淋巴細胞，用臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)（應(yīng)在95% 以上），用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3×106個/ml。將每份脾細胞懸液分2孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，一孔加75 μl ConA 液，另一孔加入75 μl培養(yǎng)液作對照。置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去0.7 ml 上清液，加入0.7 ml 不含胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液，同時按50 μl/孔加入5 mg/ml MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 ml 酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解后分裝至96 孔板中，每孔做3 個平行孔，酶標(biāo)儀570 nm 測定吸光度。按下式計算脾淋巴細胞增殖能力。脾淋巴細胞增殖能力=Con A孔吸光度值?無Con A孔吸光度值。

1.2.2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗 給藥25 d，動物腹部用薇婷脫毛膏脫毛，面積約為3 cm×3 cm，脫毛后用50 μl 的DNFB 溶液均勻涂抹脫毛區(qū)域致敏。5 d 后，用10 μl 的DNFB 溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進行攻擊，攻擊后24 h 頸椎脫臼處死小鼠，用打孔器取下直徑約為8 mm的耳片，分別稱重。計算左右耳片重量之差。

1.2.3 小鼠血清溶血素生成試驗 給藥27 d，每只小鼠腹腔注射2% 綿羊血壓積紅細胞懸液0.2 ml。給藥30 d 后動物眼眶靜脈竇采血，2000 r/min 離心10 min，取血清。用生理鹽水將血清倍半稀釋11 次共得11個稀釋度的血清，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100 μl，再加入100 μl 0.5%（v/v）的綿羊血壓積紅細胞懸液，混勻，于濕潤的平盤內(nèi)加蓋37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度：分5 級（0～Ⅳ）記錄，并按下式計算抗體積數(shù)：抗體積數(shù)=（S1+2S2+3S3+……nSn），式中1、2、3、……n代表對倍稀釋的指數(shù)，S 代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0 級，紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清澈；Ⅰ級，紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細胞；Ⅱ級，凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點；Ⅲ級，凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點；Ⅳ級，凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

1.2.4 小鼠碳廓清試驗 給藥30 d 后，各組動物按10 ml/kg 的注射體積尾靜脈注射稀釋為原液3 倍的印度墨汁。注入墨汁后2、10 min，分別從眼眶靜脈竇采血20 μl，并立即加到2 ml 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對照，用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定光密度值（OD），同時剖取肝臟和脾臟稱重，按下式計算吞噬指數(shù)a：a=體重/（肝重+脾重）（lgOD1?lgOD2）/（t2?t1）。

1.2.5 靶細胞（YAC-1）傳代 YAC-1細胞傳代培養(yǎng)3 代后，試驗時將靶細胞混懸液1000 r/min 離心10 min，沉淀細胞加入RPMI1640完全培養(yǎng)液吹散，臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)后調(diào)整細胞濃度為4×105個/ml。

1.2.6 小鼠NK 細胞活性試驗 給藥30 d 后各組動物安樂死后無菌取脾，將脾置于200 目篩網(wǎng)上并浸于無菌Hank's 液中，輕輕研磨并制成單細胞懸液，1000 r/min離心10 min，沉淀細胞經(jīng)紅細胞裂解液裂解紅細胞后，RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸淋巴細胞，用臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×107個/ml。取靶細胞YAC-1和效應(yīng)細胞（脾淋巴細胞）各100 μl（效靶比50∶1），加入U 型96 孔培養(yǎng)板中，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μl；靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%Triton 各100 μl，上述各項均設(shè)3 個平行孔，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后將U 型96 孔培養(yǎng)板離心并吸取上清100 μl 置于96 孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH 基質(zhì)液100 μl，反應(yīng)6 min 后每孔加入1 mol/L 的HCl 30 μl，在酶標(biāo)儀490 nm 處測定光密度值（OD）。按下式計算NK細胞活性：NK細胞活性（%）=（反應(yīng)孔OD?自然釋放孔OD）/（最大釋放孔OD?自然釋放孔OD）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用±s表示，應(yīng)用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗左右耳片重量差值采用秩和檢驗。其余各項試驗采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾淋巴細胞增殖試驗 結(jié)果見圖1。與陰性對照組相比，陽性對照組、組合物中、高劑量組脾淋巴細胞增殖能力明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），組合物低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1 Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖能力Fig.1 Proliferation of mice Con A-induced splenocytes

2.2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗左右耳片重量差值 與陰性對照組相比，各組左右耳片重量差值均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表1）。

表1 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗左右耳片重量差值（±s，n=10，mg）Tab.1 Weight difference between left and right ear of mice in delayed-type hypersensitivity response（±s，n=10，mg）

表1 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗左右耳片重量差值（±s，n=10，mg）Tab.1 Weight difference between left and right ear of mice in delayed-type hypersensitivity response（±s，n=10，mg）

Groups Negative control Positive control Combination low dose Combination middle dose Combination high dose Dose?20 ml/ kg 0.7 g/ kg 1.4 g/ kg 2.1 g/ kg Weight difference between left and right ear 19.2±5.120.1±2.120.6±4.019.9±2.220.4±5.5

2.3 小鼠血清溶血素生成試驗 與陰性對照組相比，陽性對照組、組合物中劑量組血清溶血素抗體積數(shù)明顯升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖2），其余各組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 小鼠血清溶血素生成試驗抗體積數(shù)結(jié)果Fig.2 Results of antibody titre level in mice serum hemo?lysin production test

2.4 小鼠碳廓清試驗 與陰性對照組相比，陽性對照組、組合物低、中劑量組吞噬指數(shù)明顯升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖3），組合物高劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)結(jié)果Fig.3 Results of phagocytic index in mice carbon clear?ance test

2.5 小鼠NK細胞活性試驗 與陰性對照組相比，陽性對照組、組合物高劑量組NK細胞活性明顯升高（P<0.05，圖4），其余各組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖4）。

圖4 小鼠NK細胞活性試驗結(jié)果Fig.4 Results of mice NK cell activity test

3 討論

免疫系統(tǒng)作為人體的一道天然屏障，具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控的作用，可分為特異性免疫和非特異性免疫，前者又分為細胞免疫和體液免疫，分別由T 淋巴細胞和B 淋巴細胞發(fā)揮作用，后者則主要由固有免疫細胞，如單核巨噬細胞，NK 細胞等發(fā)揮作用。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在評價免疫功能時也主要從細胞免疫、體液免疫、單核巨噬細胞吞噬能力及NK細胞活性這四個方面進行[11］。為此，本研究通過脾淋巴細胞增殖試驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、血清溶血素生成試驗、碳廓清試驗及NK 細胞活性試驗，評價乳清蛋白、小麥蛋白與酵母β-葡聚糖組合后對機體特異性免疫和非特異性免疫功能的影響。

試驗結(jié)果顯示，乳清蛋白和小麥蛋白配伍酵母β-葡聚糖，有2 個劑量在提高脾淋巴細胞增殖能力（1.4 及2.1 g/kg），增強巨噬細胞吞噬能力（0.7 及1.4 g/kg）上發(fā)揮作用，有1 個劑量在提高血清溶血素生成水平（1.4 g/kg）及提高NK細胞活性（2.1 g/kg）上發(fā)揮作用。由此可見，將天然蛋白提取物乳清蛋白和小麥蛋白與酵母β-葡聚糖組合，確實具有增強免疫力的功效。且其作用效果初步估計是以提高細胞免疫中的脾淋巴細胞增殖能力及增強非特異性免疫中的巨噬細胞吞噬能力為主，以提高體液免疫中的血清溶血素生成水平及增強非特異性免疫中的NK細胞殺傷活性為輔。

在特異性免疫方面，細胞免疫主要由T 淋巴細胞介導(dǎo)，T 淋巴細胞的增殖能力決定了效應(yīng)T 細胞的數(shù)量及細胞免疫應(yīng)答的強度，直接反映了機體的細胞免疫功能[12-14］。乳清蛋白和小麥蛋白在體內(nèi)可分別被水解為必需氨基酸和谷氨酸，必需氨基酸是蛋白合成的重要原料，而谷氨酸則參與三羧酸循環(huán)，為蛋白質(zhì)合成提供能源[7，15］，這些都為T 細胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，因此可發(fā)現(xiàn)在淋巴細胞增殖能力試驗中，該組合對Con A 特異性誘導(dǎo)T 淋巴細胞增殖具有良好的促進作用。T 淋巴細胞的增多，還能協(xié)助參與體液免疫的B細胞分化成漿細胞產(chǎn)生抗體和分泌相關(guān)細胞因子[16-17］，乳清蛋白中的亮氨酸和精氨酸也直接參與免疫因子的合成，酵母β-葡聚糖協(xié)助調(diào)節(jié)細胞因子表達[5，10］。因此，動物在給予該組合物30 d 后，可見介導(dǎo)體液免疫的抗體成分血清溶血素的抗體積數(shù)升高，側(cè)面反映了B細胞的增殖分化以及與補體結(jié)合后釋放抗體的能力有所上升[18］。

在非特異性免疫方面，單核巨噬細胞是非特異性免疫的重要執(zhí)行者，它有利于病原微生物的吞噬，自身衰老損傷細胞的清除，且有利于對抗原的攝取、加工、處理、提呈并激發(fā)免疫反應(yīng)[12，19-20］。酵母β-葡聚糖作為新資源食品，其獨特的三重超螺旋結(jié)構(gòu)，最容易被人體吸收，它能促進細胞有絲分裂，增加單核細胞和中性粒細胞數(shù)量[21］，也能與淋巴細胞表面受體結(jié)合，協(xié)助免疫細胞發(fā)揮作用，被多次報道具有增強巨噬細胞吞噬能力的功效，在增強非特異性免疫方面表現(xiàn)出色，當(dāng)配伍活性蛋白成分乳清蛋白和小麥蛋白后，其提高單核巨噬細胞吞噬能力的作用得到進一步提高，實驗中2 個劑量均具有提高單核巨噬細胞吞噬能力的作用，也是該組合發(fā)揮特異性免疫的主要作用層面[8-9，22］。在此以外，該組合還能提高NK 細胞活性。NK 細胞是天然防御的功能細胞，可對機體進行免疫清除和免疫監(jiān)視，其殺傷范圍遠大于T 細胞，在無致敏源刺激的情況下也能發(fā)揮免疫功能，殺傷多數(shù)受感染細胞，維護機體免受感染[17，23-24］。

通過以上的理論和實驗證明，乳清蛋白和小麥蛋白可為免疫反應(yīng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，酵母β-葡聚糖協(xié)助發(fā)揮推動效應(yīng)，三者結(jié)合可有效地提高機體的免疫效能。本次研究也為蛋白類成分及多糖類成分的組合應(yīng)用和開發(fā)提供了研究方向和基礎(chǔ)資料。