miR-194靶向Bmi-1調控PI3K/Akt信號通路對腦膠質瘤細胞遷移和凋亡的影響①

田少輝 張學浩 徐江龍 喬曉霞 張雨豪

（河北大學附屬醫院神經外科，保定071000）

腦膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，雖然發病率較低，但惡性程度較高，嚴重威脅人類健康[1］。腦膠質瘤具有惡性程度高、擴展性生長并向周圍組織浸潤的特點，臨床常采用手術、放化療治療，但均無法徹底清除腫瘤組織，導致患者免疫功能低下甚至復發，致殘率和致死率較高。因此，尋找有效且不良反應較小的藥物及治療方法至關重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度19～25個核苷酸，通過與靶基因miRNA 的3'非翻譯區結合調控基因轉錄后表達，參與調節細胞的生理和病理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡及激素生物合成和分泌[2-3］。研究證實，miR-194 參與調控非小細胞肺癌、結直腸癌、胃癌等細胞增殖與遷移，但其在腦膠質瘤中的研究較少[4-6］。

Bmi-1（B-lymphoma moloney murine leukemia vi‐rus insertion region-1）屬于多梳蛋白家族，在干細胞自我更新、細胞增殖、周期調控和抗凋亡調節等方面具有重要作用。Bmi-1 在多種癌癥中表達上調，因此被認為是癌基因，包括在神經膠質瘤中[7-9］。PI3K/Akt 途徑在各種生物學過程中均具有重要功能，且PI3K 信號傳導異常對多種疾病均有影響，包括糖尿病、帕金森病、癌癥等[10-12］。研究發現，Bmi-1通過激活PI3K/AKT 信號途徑促進胰腺癌干細胞侵襲和轉移[13］，但Bmi-1 介導PI3K/Akt 信號途徑對膠質瘤細胞的研究較少。因此，本研究探討miR-194通過靶向Bmi-1調控PI3K/Akt信號通路對腦膠質瘤細胞遷移和凋亡的影響，為腦膠質瘤臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 所有腦膠質瘤組織（30 例）和相應的癌旁非腫瘤組織（30 例）均來自我院接受腦膠質瘤切除手術的患者。所有患者手術前接受化學治療，術后進行病理診斷。所有患者知情同意，所有實驗經我院倫理委員會批準與監督。各組織標本保存于液氮中直至使用。

1.1.2 細胞 正常星形膠質HA1800 細胞株、腦膠質瘤細胞株（U251、U87、LN229）購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.1.3 試劑 DMEM 培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；TRIzol 試劑、PrimeScriptTMRT Reagen Kit試劑盒、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購自日本Ta‐KaRa 公司；NC mimics、miR-194 mimics、NC inhibi‐tor、miR-194 inhibitor、pcDNA/NC、pcDNA/Bmi-1、si-NC 和si-Bmi-1購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Li‐pofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司；免疫組織化學試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；pmir‐GLO 載體、雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國promega 公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購自美國Abcam 公司；T 兔抗Bmi-1 抗體、兔抗p-PI3K 抗體、兔抗PI3K 抗體、兔抗p-Akt 抗體、兔抗Akt 抗體、兔抗β-actin 和山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HA1800 細胞、U251 細胞、U87細胞和LN229 細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM培養基培養，37℃、5%CO2，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，2 d更換1次培養基，以保證細胞所需營養成分。

1.2.2 細胞轉染 按照LipofectamineTM3000 轉染試劑說明書將NC mimics、miR-194 mimics、NC in‐hibitor、miR-145 inhibitor 分別轉入U251 細胞，轉染終濃度為100 nmol/L；將pcDNA/NC、pcDNA/Bmi-1、si-NC、si-Bmi-1 分別轉入U251 細胞，轉染終濃度為50 nmol/L；37℃、5%CO2培養6 h，更換新鮮培養基繼續培養48 h，收集各組細胞進行后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR 采用TRIzol 試劑提取組織樣本或細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA純度和含量，將各配對樣品調節至相同濃度。采用Prime‐ScriptTMRT Reagen Kit 試劑盒將提取的RNA（miR‐NA）逆轉錄為cDNA，采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒將提取的RNA（mRNA）逆轉錄為cDNA。采用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR，FTC-3000p 實時PCR 系統完成實驗，2?ΔΔCt法分析數據，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Transwell遷移實驗 收集各組轉染48 h細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液，細胞密度為1×106個/ml。Transwell 小室上室加入細胞懸液100 μl，下室加入含10%FBS 的完全培養基500 μl，37℃、5%CO2、飽和濕度孵育8 h，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機選取5個視野，統計穿膜細胞數，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術 收集各組轉染48 h 細胞，離心，重懸于緩沖液，依次加入Annexin V-FITC 溶液（10 μl）和PI 溶液（10 μl）染色，室溫下黑暗孵育30 min，FACS CaliburTM流式細胞儀分析。

1.2.6 免疫組織化學染色 組織于4% 多聚甲醛固定，包埋，制5 μm切片，脫蠟至水，3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，3% 牛血清白蛋白封閉30 min。滴加一抗（Bmi-1 抗體）4℃孵育過夜，滴加二抗（HRP 標記的山羊抗兔）室溫孵育1 h。DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，目標蛋白呈棕黃色則為陽性表達。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因 將預測得到含miR-914 結合位點的Bmi-13'UTR 片段插入pmirGLO，得到野生型Bmi-13'UTR 的報告基因載體Bmi-13'UTR wt。將靶序列進行突變得到突變型載體Bmi-13'UTR mut。 Bmi-13'UTR wt、Bmi-13'UTR mut 與miR-194 mimics 或NC mimics 共轉染至U251 細胞，48 h 后雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定U251 細胞熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot RIPA 裂 解 液 提 取U251 細 胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉至PVDF 膜，5% 脫脂奶室溫封閉1 h，加 入p-PI3K 抗 體（1∶1000）、PI3K 抗 體（1∶1000）、p-Akt 抗體（1∶1000）、Akt 抗體（1∶1000）、β-catin 抗體（1∶2000）4℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，持續5 min，加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶5000）孵育1 h，TBST 洗滌3 次，持續5 min。顯影曝光，Image-Pro Plus圖像分析系統分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行數據分析，正態分布數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-194 在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中的表達 qRT-PCR 結果表明，與癌旁非腫瘤組織組相比，miR-194 在腫瘤組織中表達明顯下調（P<0.01，圖1A）；與HA1800 細胞相比，3 個腦膠質瘤細胞中均觀察到miR-194 呈低表達（P<0.05），其中，U251細胞中miR-194表達最低（P<0.001，圖1B），因此，選擇U251細胞進行后續實驗。

圖1 miR-194在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中的表達Fig.1 miR-194 expressions in glioma tissues and glioma cells

2.2 miR-194 對U251 細胞遷移能力的影響 Tran‐swell 遷移實驗結果表明，與NC mimics 組相比，miR-194 mimics 組U251 細胞遷移數顯著減少（P<0.001）；與NC inhibitor 組相比，miR-194 inhibitor 組U251細胞遷移數明顯增加（P<0.01，圖2）。

圖2 miR-194對U251細胞遷移能力的影響（×200）Fig.2 Effect of miR-194 on migration ability of U251 cells（×200）

2.3 miR-194 對U251 細胞凋亡率的影響 流式細胞術結果表明，與NC mimics組相比，miR-194 mimics組U251 細胞凋亡率上升（P<0.05）；與NC inhibitor組相比，miR-194 inhibitor 組U251 細胞凋亡率下降（P<0.05，圖3）。

Note：*.P<0.05.

2.4 Bmi-1 在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中的表達 免疫組織化學結果表明，與癌旁非腫瘤組織相比，Bmi-1在腫瘤組織中陽性表達率明顯上調（P<0.01 ，圖4A）；qRT-PCR結果表明，與HA1800細胞相比，U251細胞中Bmi-1表達明顯上調（P<0.01，圖4B）。

圖4 Bmi-1在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中的表達（×400）Fig.4 Bmi-1 expressions in glioma tissues and glioma cells（×400）

2.5 Bmi-1 是miR-194 的 靶 基 因 TargetScan 數 據庫分析結果顯示，Bmi-1 是miR-194 的候選目標（圖5A）。雙熒光素酶報告基因測定結果表明，miR-194 mimics 明顯抑制攜帶Bmi-13'UTR wt 的熒光素酶活性（P<0.001，圖5B），但報告質粒攜帶Bmi-13'UTR mut 時未觀察到明顯抑制作用（P>0.05）。

圖5 Bmi-1與miR-194的靶相關系Fig.5 Targeting relationship between Bmi-1 and miR-194

2.6 miR-194與Bmi-1呈負調控 qRT-PCR 結果表明，與NC mimics組相比，miR-194 mimics組中Bmi-1表達明顯下調（P<0.01），與NC inhibitor 組相比，miR-194 inhibitor 組中Bmi-1 表達明顯上調（P<0.01）；與PCDNA/NC 組相比，pcDNA/Bmi-1 組中miR-194表達顯著下調（P<0.001），與si-NC 組相比，si-Bmi-1組中miR-194表達明顯上調（P<0.01，圖6）。

圖6 miR-194與Bmi-1呈負調控Fig.6 miR-194 and Bmi-1 had a negative regulatory rela?tionship

2.7 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞遷移能力的影響 Transwell 遷移實驗結果表明，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組 相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics 組U251 細胞遷移數明顯減少（P<0.01）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組相比，si-Bmi-1+miR-194 in‐hibitor組U251細胞遷移數明顯增加（P<0.01，圖7）。

圖7 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞遷移能力的影響（×200）Fig.7 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on migrationability of U251 cells（×200）

2.8 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞凋亡率的影響 流式細胞術結果顯示，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組 相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics 組U251 細胞凋亡率顯著提高（P<0.001）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組 相 比，si-Bmi-1+miR-194 inhibitor 組U251細胞凋亡率顯著下降（P<0.001，圖8）。

圖8 miR-194靶向Bmi-1對U251細胞凋亡率的影響Fig.8 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on apoptosis rate of U251 cells

2.9 miR-194 靶向Bmi-1 對PI3K/Akt 通路相關蛋白的影響 Western blot結果表明，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics組中PI3K 蛋白磷酸化程度和Akt 蛋白磷酸化程度明顯降低（P<0.01）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組相比，si-Bmi-1+miR-194 inhibitor 組中PI3K 蛋白磷酸化程度和Akt 蛋白磷酸化程度明顯增強（P<0.001，P<0.01，圖9）。

圖9 miR-194靶向Bmi-1對PI3K/Akt通路相關蛋白的影響Fig.9 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on PI3K/Akt pathway-related proteins

3 討論

腦膠質瘤占顱內惡性腫瘤的40%～60%，手術治療生存期僅為12～18 個月[14］。目前膠質瘤臨床常規治療手段包括手術、放化療等，療效均已取得極大改善，但多數患者術后生存率仍未得到明顯改善[15］。近年分子生物學發展對腫瘤基因診斷和治療具有極大促進作用，但針對腦膠質瘤的分子靶向藥物治療尚未在臨床得到廣泛應用。尋找并鑒定具有抑制腦膠質瘤細胞增殖的小分子將為腦膠質瘤診治提供新靶點。

miR-194 是miRNA 家族成員，可抑制多種腫瘤生長、分化、侵襲、遷移及凋亡。研究顯示，miR-194在多種惡性腫瘤中異常表達，參與其分化、增殖和凋亡過程。如miR-194通過靶向NFAT5抑制高糖誘導的非小細胞肺癌細胞進程[16］；miR-194 通過抑制RAP2B 抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲[17］。本研究表明，miR-194 在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中呈低表達，且過表達miR-194 抑制U251 細胞遷移、促進其凋亡。

Bmi-1 基因是PcG 家族核心成員之一，對胚胎期哺乳動物骨骼、造血及神經發育發揮重要作用。腫瘤細胞中，Bmi-1 呈高表達，促進腫瘤細胞不斷更新為癌癥干細胞，其表達與腫瘤發生、發展、侵襲、預后等病理指標相關[18-19］。本研究發現，Bmi-1在腦膠質瘤組織和腦膠質瘤細胞中呈高表達，過表達Bmi-1 導致U251 細胞遷移能力增加，凋亡率下降；且過表達miR-194 可逆轉Bmi-1 過表達引起的U251細胞遷移能力增強，凋亡率下降。

PI3K/Akt 信號通路在腦膠質瘤細胞中過度活化，促進腦膠質瘤細胞侵襲、轉移等[20］。本研究發現，PI3K/Akt 通路在Bmi-1過表達的腦膠質瘤細胞中被激活，且過表達miR-194可抑制PI3K/Akt通路激活。

綜上所述，本研究驗證了miR-194與Bmi-1的相互作用關系，過表達miR-194 抑制Bmi-1 表達，使PI3K 和Akt 蛋白磷酸化程度降低，從而抑制腦膠質瘤細胞遷移，促進其凋亡。因此，miR-194 有望成為腦膠質瘤治療靶點。