半乳糖凝集素-3（Gal-3）在卵巢癌細胞系中的表達及其對NK細胞殺傷活性的影響①

張 蕊 張 瑾 安 娜

（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院婦產科，北京100038）

卵巢癌是女性生殖系統致死率最高的惡性腫瘤，上皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma，EOC）是最常見的病理類型[1］。由于卵巢癌發病隱匿，且早期無明顯特異性臨床癥狀，故多數患者就診時已發展為中晚期。盡管近年手術聯合化療的治療方案顯著提高了臨床療效，但卵巢癌總體療效及預后仍不理想[2］。半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）是β-糖苷凝聚家族成員，廣泛存在于生物體內，參與調控細胞生長、凋亡、胚胎發育、免疫及腫瘤發生發展等多種生理病理過程[3］。近年研究發現，Gal-3在乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等多種腫瘤中表達顯著增加[4-6］。研究報道，Gal-3在EOC腫瘤組織中呈顯著高表達，且與病理類型、化療敏感性及預后相關[7-9］。自然殺傷（natural killer，NK）細胞是先天免疫系統的效應淋巴細胞，也是體內抵御腫瘤的第一道防線。NK細胞主要通過其表面的激活受體和抑制性受體與靶細胞表面的相應配體結合，介導活化性或抑制性信號發揮其免疫功能[10］。既往研究證實，EOC患者NK細胞免疫功能明顯受損，其中激活受體NKp30表達顯著降低[11］。最新研究發現，宮頸癌及乳腺癌細胞中Gal-3可作為NKp30的抑制性配體抑制NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，從而促進腫瘤免疫逃逸[12］。EOC中高表達的Gal-3能否以同樣的作用機制調控NK細胞功能尚未闡明。本研究通過檢測Gal-3在EOC細胞系中的表達及分布，探究其對NK細胞激活受體NKp30的作用，以闡明其對NK細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 正常卵巢上皮細胞IOSE80與EOC細胞系Hey、ES2及與SKOV3（南京凱基生物公司細胞庫）；RPMI1640、DMEM/HG、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；NK細胞培養基（美國Cell Gro公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（100 U/ml，杭州四季青生物公司）；人重組可溶性Gal-3（Gal-3）、NKp30-Fc融合蛋白、Gal-3 ELISA檢測試盒（美國R＆D公司）；淋巴細胞分離液（美國Sigma公司）；MACS免疫磁珠分選柱、MACS緩沖液、CD56+CD16?磁珠分選試劑盒（德國Miltenyi biotec公司）；兔抗人CD107a-PerCP cy5.5、兔抗人CD56-FITC、CD3-APC、NKp30-PE、小鼠抗人IgG-FITC（美國Biolegend）；NK細胞殺傷活性檢測試劑盒（美國Promega公司）；PCR試劑盒（日本TaKaRa）；大鼠抗人NKp30、Gal-3、GAPDH單克隆抗體（美國Affinity公司）；辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗大鼠IgG（廣州晶彩生物公司）；PCR引物由上海生工合成，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞分離、純化及鑒定 選取我院體檢科健康體檢者外周靜脈血分離NK細胞，800 g離心10 min，收集底層沉淀血細胞。根據淋巴細胞分離液說明書，采用Ficoll不連續密度梯度分離法獲得人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），PBS洗滌，按照NK細胞免疫磁珠分選系統操作說明，PBS重懸，計數，取20 μl（約1×107個）細胞懸液，加入抗CD3免疫磁珠，4℃孵育15 min，加入2 ml PBS離心洗滌細胞，定容至500 μl，緩慢過MACS層析柱，沖洗柱子，收集未結合細胞（即CD3?細胞），PBS洗滌，重復上述步驟，加入抗CD56免疫磁珠，過柱，收集結合于層析柱的細胞，即為CD3?CD56+NK細胞，PBS重懸，離心洗滌，計數，取部分NK細胞采用CD56-FITC、CD3-APC流式抗體進行鑒定。NK細胞于NK細胞培養基中（37℃、5%CO2）培養。

1.2.2 細胞培養及轉染 IOSE80與Hey、ES2及SKOV3細胞系均采用含10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640培養液于37℃、5%CO2培養，待細胞生長至80%～90%融合時采用0.25%胰酶消化傳代。轉染前24 h，取對數生長期SKOV3細胞進行常規消化，計數，以1×106個/ml接種于6孔板，待細胞生長至80%融合，根據LipofectamineTM3000說明書將si-Gal-3、si-NC轉染至SKOV3細胞，37℃、5%CO2培養8 h，檢測轉染效率，用于后續實驗。

1.2.3 免疫共沉淀實驗 收集上述分離純化的NK細胞，采用含蛋白酶抑制的細胞裂解液RIPA buffer于冰上裂解，4℃、1000 g離心30 min，取50 μl上清（即NK細胞裂解物，NK lysate）與20 μg/ml Gal-34℃預處理2 h，制備NK lysate+Gal-3樣品。將終濃度為10 μg/ml的抗NKp30或Gal-3抗體1 μl分別加入NK lysate+Gal-3樣品，4℃孵育過夜。次日取10 μl protein A瓊脂糖磁珠，RIPA buffer洗滌3次，800 g離心3 min，將其加入與抗體孵育過夜的NK lysate+Gal-3樣品中，4℃孵育4 h，使抗體與磁珠充分偶聯。4℃、300 g離心3 min，取底層沉淀磁珠，RIPA buffer充分洗滌，加入20 μl 2×SDS上樣緩沖液，沸水中加熱變性10 min，進行Western blot實驗。

1.2.4 流式細胞術檢測NK細胞表面蛋白表達收集NK細胞，分別置于終濃度為10 μg/ml的3%BSA或Gal-34℃孵育30 min，PBS充分洗滌，加入Gal-3-PE或NKp30-FITC 4℃孵育30 min，300目濾膜過濾，進行流式細胞術檢測：收集細胞，采用含1%多聚甲醛、3%BSA的PBS冰上處理30 min，PBS充分洗滌，采用含3%BSA的破膜液4℃孵育30 min，加入終濃度為10 μg/ml的Gal-3-FITC，其余步驟同前。檢測不同處理條件下NK細胞殺傷SKOV3細胞時NK細胞表面CD107表達：預先將NK細胞分別置于終濃度為10 μg/ml的3%BSA或Gal-3或Gal-3+NKp30-Fc，4℃孵育30 min，PBS充分洗滌，按一定比例加入SKOV3細胞進行NK細胞殺傷活性檢測，收集所有細胞，計數，加入CD3-APC、CD56-FITC與CD107a-PerCP cy5.5，其余步驟同前。實驗重復3次。

1.2.5 ELISA取約5×104個SKOV3細胞接種于96孔板，取上清，采用ELISA檢測試劑盒測定上清中Gal-3表達（6 h、12 h、24 h、36 h）。

1.2.6 LDH釋放法檢測NK細胞殺傷活性 取生長狀態良好的SKOV3細胞（靶細胞），以NK細胞為效應細胞。按照NK細胞殺傷活性檢測試劑盒說明進行LDH釋放實驗：將分離純化的NK細胞與SKOV3細胞分別調整至5×104個/孔與1×104個/孔，接種至96孔板作為實驗孔，設置分別含1×104個/孔或5×104個/孔的靶細胞或效應細胞作為靶細胞或效應細胞自發釋放孔，另設含1×104個/孔的靶細胞培養液（孵育結束45 min前加入10 μl lysis solution）作為靶細胞最大釋放孔。上述每孔均含10%FBS RPMI1640培養液100 μl，37℃、5%CO2恒溫培養箱共培養4 h，收集上清。取適量上清，加入底物（1∶1）室溫避光反應30 min，加入等體積終止液于490 nm處檢測各孔吸光度（OD）。以上各組均設5個復孔，NK細胞殺傷活性（%）=（OD實驗孔?OD效應細胞自發釋放?OD靶細胞自發釋放）/（OD靶細胞最大釋放?OD靶細胞自發釋放）×100%。檢測封閉NKp30后對NK細胞殺傷活性的影響時，預先將NK細胞置于終濃度為10 μg/ml的3%BSA或Gal-3或Gal-3+NKp30-Fc 4℃孵育30 min，再將NK細胞與靶細胞進行共培養，按上述方法進行檢測。

1.2.7 Western blot采用RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑于冰上提取待測細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，按1∶4向上清中加入5×上樣緩沖液，沸水中加熱變性10 min，取35 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉法轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入Gal-3（1∶300）、NKp30（1∶300）、GAPDH（1∶2000）一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，以HRP標記的二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，TBST清洗3次，5 min/次，在載有蛋白條帶的PVDF膜上均勻滴加ECL發光液，凝膠成像儀曝光拍照，Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH比值作為其相對含量，實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Gal-3在EOC細胞系中的表達 Western blot、流式細胞術及ELISA檢測正常卵巢上皮細胞IOSE80與EOC細胞系Hey、ES2及與SKOV3中Gal-3蛋白表達及分布，結果顯示，與IOSE80細胞相比，Gal-3在EOC細胞系中的表達均顯著增加（P<0.01，圖1A），取Gal-3蛋白水平較高的SKOV3細胞進行后續實驗。流式細胞術檢測結果顯示，Gal-3蛋白主要分布于SKOV3細胞細胞質，少量表達于細胞膜，ELISA結果表明，隨細胞培養時間延長，Gal-3蛋白含量隨之增加，在24 h時達到最高（P<0.05，圖1B、C）。

圖1 Gal-3在EOC細胞系中的表達Fig.1 Expression of Gal-3 in EOC cell lines

2.2 Gal-3特異性結合于NK細胞NKp30受體 流式細胞術鑒定分離所得NK細胞純度，結果顯示，CD3?CD56+NK細胞純度達80%以上（圖2A）；流式細胞術與免疫共沉淀實驗結果顯示，與BSA處理的NK細胞相比，加入Gal-3蛋白可顯著降低NK細胞表面NKp30受體表達（P<0.05），且Gal-3可與NK細胞表面NKp30受體特異性結合（圖2B、C）。

圖2 Gal-3與NK細胞表面NKp30受體特異性結合Fig.2 Specific binding of GAL-3 to NKp30 receptor on NK cell surface

2.3 Gal-3通過NKp30影響NK細胞對EOC細胞的殺傷作用 流式細胞術檢測不同處理情況NK細胞膜表面CD107a表達，結果顯示，Gal-3處理后，NK細胞表面CD107a表達較BSA與Gal-3+NKp30-Fc處理后顯著降低（P<0.05），BSA與Gal-3+NKP30-Fc組差異無統計學意義（P>0.05）。NK細胞殺傷實驗結果同樣證實Gal-3預處理后，NK細胞殺傷活性較BSA與Gal-3+NKp30-Fc處理后的NK細胞顯著降低（P<0.05），BSA組與Gal-3+NKp30組細胞殺傷活性差異無統計學意義（P>0.05，圖3A、B）。

圖3 Gal-3抑制NKp30介導的NK細胞對EOC細胞的殺傷作用Fig.3 Gal-3 inhibits NK cells mediated by NKp30 to kill EOC cells

2.4 Gal-3作為抑制配體阻斷NK細胞對EOC細胞的殺傷活性 siRNA沉默SKOV3細胞Gal-3表達，Western blot結果顯示，轉染si-Gal-3后SKOV3細胞Gal-3蛋白表達顯著降低（P<0.05，圖4A）。NK細胞殺傷實驗結果顯示，與轉染si-NC的SKOV3細胞相比，沉默Gal-3蛋白后NK細胞對其殺傷能力明顯增強（P<0.05，圖4B）。

圖4 抑制EOC細胞中Gal-3表達顯著促進NK細胞對其殺傷活性Fig.4 Inhibition of Gal-3 expression in EOC cell signifi?cantly promoted NK cells'cytotoxic activity against EOC cellNote：A.Gal-3 protein expression in SKOV3 cells detected by Western blot；B.NK cells cytotoxicity to SKOV3 cells transfected with si-Gal-3 detected by LDH release method.Compared with si-NC group，*.P<0.05.

3 討論

半乳糖凝集素家族是一類對β-半乳糖糖苷具有特殊親和力，且在碳水化合物識別區域具有相似氨基酸序列的蛋白，而Gal-3是該家族中唯一的嵌合型代表，不僅具有相似的碳水化合物識別區域，還具有1個富含脯氨酸與甘氨酸的NH2端[3］。由于Gal-3上述特殊結構，研究者對其分子作用尤為重視。既往研究發現，Gal-3廣泛存在于肺、腎臟、乳腺、皮膚、前列腺及卵巢等多種器官與組織中，且Gal-3在人體多個系統腫瘤中均呈異常高表達，進一步研究證實，Gal-3與非小細胞肺癌、乳腺癌、黑色瘤等腫瘤細胞侵襲、轉移及患者預后密切相關[7-9］。KIM等[7］研究發現，Gal-3在EOC組織中顯著高表達，且免疫組織化學染色證實其主要表達于癌細胞細胞質，同時EOC患者高表達Gal-3與更短的無進展生存期（progression-free survival，PFS）相關。Gal-3在EOC中的表達較正常卵巢癌組織明顯增加，且與患者病理類型、鉑敏感性相關，同時患者分期越晚，Gal-3表達越高，提示Gal-3可能參與EOC發生發展，進一步體外研究發現，下調EOC細胞系中Gal-3表達可通過調控細胞周期蛋白CyclinD1、基質金屬蛋白酶MMP-9及E-鈣黏蛋白表達抑制癌細胞增殖、遷移及侵襲[8-9，13］。

免疫系統中，最初發現Gal-3可表達于巨噬細胞，隨著研究深入，Gal-3已被證實在樹突狀細胞、肥大細胞、T細胞、B細胞及NK細胞等多種免疫細胞中表達，進一步研究表明其在先天性免疫與適應性免疫調控中具有重要地位[14］。大量研究表明，免疫細胞中Gal-3可與不同分子相互作用調控免疫細胞黏附、活化、凋亡、趨化及細胞因子分泌等多個生理病理過程[15］。NK細胞是先天免疫應答系統中的重要功能執行細胞，發揮類似CD8+細胞毒性T細胞功能，可直接殺傷感染病原體細胞及腫瘤細胞，而NK細胞無需抗原提呈，通過自身表面激活或抑制性受體識別環境中的可溶性配體，如細胞因子或細胞在病理條件下呈現的表面抗原分子，并通過整合所接受到的活化及抑制性信號發揮相應免疫功能[16］。NKp30是由位于人類6號染色體的1C7基因所編碼的分子量為30 kD的蛋白，作為激活性受體選擇性地表達于所有NK細胞表面[17］。最新研究表明，宮頸癌Hela細胞及乳腺癌MDA-MB-435細胞中Gal-3可作為NKp30的可溶性抑制性配體阻礙NK細胞免疫功能，采用慢病毒過表達或下調這2種腫瘤細胞中Gal-3表達可促進或抑制NK細胞對其的殺傷作用，且在裸鼠體內實驗中得到證實[12］。本研究通過Western blot檢測Gal-3在EOC細胞系Hey、ES2及與SKOV3中的表達，結果表明其在EOC細胞系的表達較正常卵巢上皮細胞顯著增加，選擇EOC細胞系中表達水平較高的SKOV3細胞進行研究。既往研究證實，Gal-3蛋白主要分布于EOC細胞細胞質，且EOC患者血清中Gal-3表達顯著增加，提示在卵巢癌細胞中高表達的Gal-3可能以外分泌方式釋放至周圍環境[13］。本實驗結果同樣證實Gal-3主要表達于SKOV3細胞細胞質，且能夠以外分泌方式釋放至周圍環境。分離純化正常人外周血中NK細胞，鑒定純度后，采用人重組可溶性Gal-3蛋白處理NK細胞，流式細胞術及免疫共沉淀實驗結果證實Gal-3可與NK細胞表面NKp30受體結合。課題組進一步采用Gal-3或Gal-3與NKp30-Fc處理NK細胞觀察Gal-3是否能夠通過NKp30影響NK細胞對SKOV3細胞的殺傷作用，結果表明，Gal-3預處理后，NK細胞CD107a表達及對SKOV3細胞的殺傷作用顯著降低，預先采用NKp30-Fc融合蛋白封閉Gal-3，NK細胞CD107a表達及殺傷功能則不受影響。CD107a是NK細胞或T細胞被抗原特異性細胞活化后所表達的與脫顆粒過程密切相關的分子表型，脫顆粒則是穿孔素、顆粒酶依賴性靶細胞殺傷過程中的關鍵步驟，故CD107a常作為NK細胞脫顆粒的標記分子[18］。進一步采用siRNA轉染技術沉默SKOV3細胞Gal-3表達，并檢測NK細胞對轉染后的卵巢癌細胞殺傷活性，結果顯示，下調癌細胞Gal-3表達可顯著促進NK細胞對其的殺傷能力，進一步證實Gal-3可作為抑制性配體下調NKp30所介導的NK細胞對卵巢癌細胞的免疫作用。

綜上，本研究發現，高表達于卵巢癌細胞細胞質中的Gal-3能夠以外分泌方式被釋放至周圍環境，并作為NK細胞表面受體NKp30的抑制性配體抑制NK細胞免疫功能，從而促進卵巢癌細胞免疫逃逸。本研究為Gal-3在卵巢癌免疫調節中的作用機制提供了新見解，Gal-3是否通過其他途徑調控免疫系統有待進一步研究。