miR-128-3p通過調控Notch1表達影響子宮內膜癌細胞的增殖和凋亡①

顧曉荔 任曉爽 廖予妹（鄭州大學第二附屬醫院婦產科，鄭州450014）

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其發病率逐年增長及年輕化[1］。近年來，隨著醫療水平的進步，EC的治療取得巨大進步，但晚期患者易復發和轉移，預后較差[2］。目前，EC的發病機制尚未明確。因此，探討EC發生、發展的分子機制并尋找基因治療靶點對于EC的治療和預后改善具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼RNA，通過與靶信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區（3'untrans‐lated region，3'UTR）靶向結合，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯，進而調控靶基因的表達，影響細胞的生長、凋亡和分化等生命過程[3］。研究顯示，miR-128-3p參與調控肝癌、食管癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移，在腫瘤的發生和發展過程中起重要作用[4-6］。但目前，miR-128-3p對EC細胞增殖和凋亡的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，Notch1的3'UTR存在與miR-128-3p結合的連續位點，提示Notch1是miR-128-3p的靶基因。Notch1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在腫瘤細胞生長、增殖和凋亡過程中起重要調控作用[7］。研究顯示，Notch1蛋白在EC組織中陽性表達率升高，其表達與患者腫瘤淋巴結轉移、分化程度等臨床病理特征密切相關，參與調控EC細胞的增殖和凋亡[8-9］。目前，miR-128-3p能否通過調控Notch1表達影響EC細胞的增殖和凋亡也還未知。本研究首先檢測了EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平，然后探討了過表達miR-128-3p或低表達Notch1對EC細胞增殖和凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響，并驗證了miR-128-3p能否通過調控Notch1表達影響EC細胞增殖和凋亡，以期為EC的靶向分子治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內膜血管內皮細胞hEEC、EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RP‐MI1640培養基（美國Hycolne公司）；四甲基噻唑藍（methylthiazoletrazolium，MTT）、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人Notch1、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）和活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（Jackson公司），膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；miR-128-3p模擬物（mimics）及陰性序列、miR-128-3p抑制劑及陰性序列、Notch1的小干擾RNA（si-Notch1）及亂序無意義陰性序列（si-NC，廣州銳博生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 子宮內膜血管內皮細胞hEEC、EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA均用含10%FBS的RPMI1640培養基于培養箱中（37℃、CO2體積分數5%、濕度97%）培養。每隔2 d更換1次新鮮的培養基。待細胞融合至80%～90%時，0.25%胰蛋白酶溶液消化，進行傳代培養。

1.2.2 Ishikawa細胞轉染和分組 對數增殖期的Ishikawa細胞，以1×105個/孔接種于6孔板中。待細胞融合至60%時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。分別將miR-128-3p mimcs（miR-128-3p組）及陰性序列（miR-NC組）、miR-128-3p抑制劑（anti-miR-128-3p組）及陰性序列（anti-miR-NC組）、Notch1的小干擾RNA（si-Notch1）及亂序無意義陰性序列（si-NC）轉染至Ishikawa細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基，繼續培養至48 h。收集細胞，RT-qPCR檢 測miR-128-3p或Western blot檢 測Notch1蛋白水平以評價轉染效果。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-128-3p和Notch1 mRNA表達 Trizol試劑提取細胞中總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環。miR-128-3p上游5'-GGAATTCAAC‐CAACTGTCAATAACTGGAG-3'，下游5'-CGGGATC‐CAATTTGTCATCCAAATCTACTTTGG-3'；Notch1上游5'-CGTGTGAACCCGTAGGCGCC-3'，下游5'-GGCCAACGTGTGCAAGCGACGGC-3'；U6上游5'-TGAACGCCGAGGGTGAGTGTCG-3'，下 游5'-CGGAAC‐GTGACGTGTGGCGTACG-3'；GAPDH上 游5'-GCGATAAGTGCTGAGCTGCTC-3'，下游5'-GTTGACGC‐GAACTGACGTGT-3'。miR-128-3p以U6為內參，Notch1以GAPDH為內參，2?ΔΔCt法計算miR-128-3p和Notch1 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 MTT檢測Ishikawa細胞增殖 轉染后的各組Ishikawa細胞，以5×103個/孔細胞接種于96孔板中，培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT，繼續孵育4 h。棄去培養基，每孔加入150 μl二甲基亞砜，反應5 min，混勻后于酶標儀490 nm處測定吸光度值（A）。每組設置3個復孔，實驗重復3次，取平均值。細胞存活率（%）=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測Ishikawa細胞凋亡 轉染后的各組Ishikawa細胞，以1×104個/孔細胞接種于24孔板中，培養箱中培養48 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，加入適量預冷的PBS清洗細胞2次。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，加入400 μl結合緩沖液，輕輕吹打混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液，渦旋混勻后流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western blot法檢測細胞中Notch1、cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，4℃、12000 r/min離心5 min，保留上清液。BCA法測定上清中蛋白濃度對蛋白進行定量。取適量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔20 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，濕轉至聚偏乙烯二氟膜，并置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入稀釋后的Notch1（1∶500）、cyclinD1（1∶100）、cleaved-cas‐pase-3（1∶1000）和β-actin（1∶8000）抗體，4℃冰箱孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。洗膜后，滴加化學發光試劑ELC，避光顯影后使用ZF-258型凝膠成像系統（上海嘉鵬科技有限公司）曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對表達水平以期蛋白條帶灰度值與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-128-3p與Notch1靶向關系 Starbase軟件預測顯示，Notch1的3'UTR含有與miR-128-3p結合的連續位點。采用PCR技術擴增含miR-128-3p結合位點的Notch1的3'UTR序列，將其克隆至psiCHECK-2質粒中，構建Notch1野生型載體（WT-Notch1）。利用基因定點突變技術將結合位點突變后，克隆至psiCHECK-2質粒，構建Notch1突變型載體（MUT-Notch1）。Ishi‐kawa細胞1×105個/孔接種于6孔板中。待細胞融合至60%時，分別共轉染WT-Notch1、MUT-Notch1與miR-128-3p mimic或miR-NC至Ishikawa細胞。轉染12 h后，收集細胞，檢測各組熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，各組的熒光素酶活性以熒光蟲活性與海腎熒光強度的比值表示。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件對實驗數據進行分析。符合正態分布的計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平與hEEC細胞比較，EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA中miR-128-3p表 達 水平 降低（P<0.05），Notch1 mRNA和蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖1和表1。

圖1 Western blot檢測EC細胞系中Notch1蛋白表達Fig.1 Western blot detected expression of Notch1 protein in EC cell lines

表1 EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平（±s，n=9）Tab.1 Expression levels of miR-128-3p and Notch1 pro?tein in EC cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with hEEC group，1）P<0.05.

Groups hEEC HEC-1A Ishikawa AN3CA F P miR-128-3p 1.00±0.100.32±0.031）0.22±0.021）0.40±0.041）344.0930.000 Notch1 mRNA 1.02±0.113.02±0.301）3.76±0.381）2.76±0.281）149.1270.000 Notch1 protein 0.35±0.040.76±0.081）0.98±0.101）0.85±0.091）102.1150.000

2.2 過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 miR-128-3p組Ishikawa細胞中miR-128-3p水平高于miR-NC組（P<0.05），說明miR-128-3p mimics轉染成功，Ishikawa細胞中miR-128-3p過表達。與miR-NC組比較，miR-128-3p組Ishikawa細胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低（P<0.05），細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）。見圖2和表2。

圖2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells

表2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

表2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p t P miR-128-3p 1.00±0.103.22±0.321）19.8650.000 CyclinD11.21±0.120.45±0.051）17.5380.000 Cleaved-caspase-30.36±0.040.88±0.091）15.8390.000 Cell viability（%）100.85±10.0861.24±6.121）10.0770.000 Apoptosis rate（%）6.43±0.6420.19±2.021）19.4810.000

2.3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 si-Notch1組Ishikawa細胞中Notch1蛋白水平低于si-NC組（P<0.05），說明Notch1小干擾RNA轉染成功，Ishikawa細胞中Notch1表達降低。與si-NC組比較，si-Notch1組Ishikawa細胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低（P<0.05），細胞凋亡率和cleaved-cas‐pase-3蛋白水平升高（P<0.05）。見圖3和表3。

圖3 Western blot檢測Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達Fig.3 Western blot detected expressions of Notch1，cy?clinD1 and cleaved-caspase-3 proteins

表3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

表3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-Notch1 t P Notch10.96±0.100.35±0.041）16.9910.000 CyclinD11.18±0.120.40±0.041）18.4990.000 Cleaved-caspase-30.38±0.040.80±0.081）14.0870.000 Cell viability（%）100.76±10.0752.19±5.221）12.8460.000 Apoptosis rate（%）6.51±0.6522.37±2.241）20.4000.000

2.4 miR-128-3p靶向調控Notch1表達 Starbase軟件預測顯示，Notch1的3'UTR含有與miR-128-3p結合的連續位點（圖4A）。雙熒光素酶活性檢測顯示，miR-128-3p mimics與WT-Notch1共轉染組熒光素酶活性低于miR-NC與WT-Notch1共轉染組（P<0.05），而miR-128-3p mimics與MUT-Notch1共轉染組與miR-NC與MUT-Notch1共轉染組相比熒光素酶活性無顯著性差異（P>0.05），說明miR-128-3p可與Notch1的3'UTR靶向結合。miR-128-3p組Notch1蛋白水平低于miR-NC組（P<0.05），anti-miR-128-3p組Notch1蛋白水平高于anti-miR-NC組（P<0.05），進一步說明miR-128-3p在Ishikawa細胞中靶向負調控Notch1表達。見圖4、表4、表5。

圖4 miR-128-3p靶向調控Notch1表達Fig.4 miR-128-3p targeted regulation of Notch1 expres?sion

表4 雙熒光素酶活性檢測結果（±s，n=9）Tab.4 Results of dual luciferase activity detection（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶活性檢測結果（±s，n=9）Tab.4 Results of dual luciferase activity detection（±s，n=9）

Note：Compared with the miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p t P Relative luciferase activity WT-Notch11.00±0.100.42±0.041）16.1550.000 MUT-Notch11.08±0.111.05±0.120.5530.588

表5 miR-128-3p對Notch1蛋白表達的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro?tein（±s，n=9）

表5 miR-128-3p對Notch1蛋白表達的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro?tein（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p anti-miR-NC anti-miR-128-3p F P Notch10.95±0.100.36±0.041）1.02±0.111.36±0.142）143.5770.000

2.5 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 與miR-128-3p+pcDNA-NC組 比 較，miR-128-3p+pcDNA-Notch1組Ishikawa細胞存活率、Notch1和cyclinD1蛋白水平升高（P<0.05），細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P<0.05）。見圖5和表6。

圖5 Western blot檢測Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達Fig.5 Western blot detected expressions of Notch1，cyclinD1 and cleared-caspase-3 proteins

表6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 t P Notch10.40±0.040.82±0.081）14.0870.000 CyclinD10.43±0.041.02±0.111）15.1220.000 Cleaved-caspase-30.89±0.090.48±0.051）11.9470.000 Cell viability（%）62.10±6.2190.01±9.011）7.6520.000 Apoptosis rate（%）20.28±2.0310.11±1.011）13.4560.000

2.6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與miR-NC組比較，miR-128-3p組Ishikawa細胞β-catenin蛋白水平降低（P<0.05）。與miR-128-3p+pcDNANC組比較，miR-128-3p+pcDNA-Notch1組β-catenin蛋白水平升高（P<0.05）。見圖6和表7。

表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression（±s，n=9）

表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達（±s，n=9）Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 F P β-catenin 0.77±0.080.30±0.031）0.27±0.020.65±0.072）179.3100.000

3 討論

miRNA的長度約為18～25個核苷酸，在轉錄后調控靶基因的表達，影響腫瘤的發生、發展。miR-128-3p是近年來新發現的一種miRNA。CHEN等[10］研究顯示，間變性甲狀腺癌細胞和組織中miR-128-3p表達水平降低，過表達miR-128-3p可降低癌細胞活力，并誘導細胞凋亡。FU等[11］研究顯示，miR-128-3p在膠質瘤組織中表達降低，過表達miR-128-3p通過靶向抑制gremlin1表達抑制膠質瘤細胞活性。ZHAO等[12］研究顯示，過表達miR-128-3p通過靶向抑制LIM結構域激酶1表達抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。目前，還未見miR-128-3p影響EC細胞生物學行為的相關報道。

本研究顯示，miR-128-3p在EC細胞系中表達降低，提示miR-128-3p作為促癌基因參與該疾病的發生發展。通過轉染miR-128-3p mimics構建過表達miR-128-3p的Ishikawa細胞，結果顯示，過表達miR-128-3p后，Ishikawa細胞存活率降低，凋亡率升高，提示過表達miR-128-3p抑制Ishikawa細胞增殖，促進細胞凋亡。cyclinD1是細胞周期調控蛋白，促進細胞由G1期向S期轉變，加速細胞增殖[13］。cas‐pase-3是caspase級聯反應的關鍵調控蛋白，其活化后促進細胞凋亡[14］。本研究顯示，過表達miR-128-3p可降低Ishikawa細胞中cyclinD1蛋白表達，促進活化的caspase-3蛋白表達，提示miR-128-3p通過調控cyclinD1和活化的caspase-3蛋白表達影響Ishikawa細胞的增殖和凋亡。為了進一步探討miR-128-3p影響EC細胞增殖和凋亡的作用機制，本研究生物信息學遇見預測顯示，Notch1可能是miR-128-3p的靶基因。本研究通過雙熒光素酶活性檢測證實了miR-128-3p可與Notch1的3'UTR靶向結合。此外，上調Ishikawa細胞中miR-128-3p表達后，Notch1蛋白表達降低，而下調miR-128-3p表達后，Notch1蛋白表達升高，進一步說明miR-128-3p靶向負調控Notch1表達。

Notch1是Notch受體家族成員之一，在胰腺導管腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤中發揮促癌作用[15-16］。本研究結果顯示，EC細胞系中Notch1 mRNA和蛋白表達升高，低表達Notch1可抑制EC細胞增殖，并誘導細胞凋亡，與相關研究結果一致，提示Notch1作為促癌基因參與EC發生發展，靶向抑制其表達對于該疾病的治療具有重要意義[9］。本研究還顯示，過表達Notch1逆轉了過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響，提示過表達miR-128-3p通過靶向抑制Notch1表達，進而抑制Ishikawa細胞增殖，并促進細胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路的激活可引起β-catenin轉位至細胞核，激活下游靶基因如cyclinD1、c-myc等表達，從而參與腫瘤的發生、發展。如彭寧等[17］研究顯示，沉默肝癌細胞中ZNF674-AS1的表達可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。研究已表明，抑制Wnt/βcatenin信號通路的激活可抑制EC細胞增殖、遷移和侵襲[18-19］。本研究結果顯示，過表達miR-128-3p可降低Ishikawa細胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表達，而過表達Notch1逆轉了過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表達的抑制作用，提示過表達miR-128-3p通過抑制Notch1表達，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活影響Ishikawa細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-128-3p在EC細胞中呈低表達，過表達miR-128-3p可抑制EC細胞增殖，并促進細胞凋亡，其可能通過靶向抑制Notch1表達及Wnt/βcatenin信號通路的激活發揮作用，是EC治療的潛在分子靶點。