沉默LncRNA TUG1通過上調miR-214-5p表達增加乳腺癌細胞的放射敏感性

孫露陽 葛鎖華 彭俊華 周 紅（江蘇大學附屬金壇醫院檢驗科，常州213200）

乳腺癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，隨著現代社會節奏的加快，乳腺癌發病率逐年上升，已嚴重影響患者生活質量[1］。目前乳腺癌的治療方式為手術并輔以放療或化療，但術后患者預后差且極易發生轉移[2］。研究表明，長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1（long noncoding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1）可促進人乳腺癌細胞增殖和轉移[3］。LncRNA TUG1和微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）間的雙負反饋環促進人膀胱癌細胞的上皮間充質轉換和放射抵抗性[4］。下調LncRNA TUG1的表達可通過抑制HMGB1表達來增強膀胱癌的放射敏感性[5］。然而，TUG1對乳腺癌細胞放射敏感性的影響仍然未知。miR-214可通過靶向抑制ATG12及其介導的自噬作用增加結直腸癌的放射敏感性[6］。miR-214通過抑制自噬作用提高乳腺癌細胞對他莫昔芬和富維斯特的敏感性[7］。然而，miR-214對乳腺癌放射敏感性的影響仍未完全闡明。starBase預測發現，TUG1與miR-214-5p具有互補結合的核苷酸位點，提示TUG1可通過充當miR-214-5p的海綿分子調控乳腺癌細胞的放射敏感性。因此，本研究通過檢測TUG1的表達及其對乳腺癌細胞的放射敏感性及細胞凋亡的調控作用，探究TUG1與miR-214-5p的靶向作用關系及其可能的作用機制，為乳腺癌診療及提高治療效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺上皮細胞MCF-10A與乳腺癌MCF-7細胞均自美國ATCC細胞庫。RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司；Li‐pofectamine2000轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司；TUG1干擾質粒、miR-214-5p mimics、miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）及其各自相應的陰性對照購自上海吉瑪生物科技有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報告基因載體及其檢測熒光素酶活性試劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對象及放射敏感性判定 選取2015年4月至2016年3月于本院就診的45例乳腺癌患者為研究對象，所有患者均經手術病理證實為乳腺癌，年齡為42～65歲，平均為（55.26±5.36）歲。納入標準：臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期；病理學診斷為乳腺浸潤性導管癌；患者入組前均未接受任何治療；接受放化療并接受放化療后的臨床評估；臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；患有自身免疫性疾病者；肝、腎等重要組織器官嚴重損害者；依從性較差者。乳腺癌放射敏感性判定：根據放療后病灶變化情況進行判定，放療后原發腫瘤或部分腫瘤未出現未控及復發患者作為放射敏感組（25例），腫瘤未控及出現腫瘤復發患者作為放射抵抗組（20例），所有患者均于手術中切取乳腺癌組織，迅速放入液氮中，術后轉移至?80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 放射抵抗的乳腺癌細胞MCF-7R的建立取對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞，使用200 cGy射線照射細胞，37℃、5%CO2培養箱繼續培養，每隔24 h更換1次培養液，待存活的細胞處于對數生長期時進行傳代培養，當細胞穩定傳代后進行400 cGy射線照射細胞，重復上述步驟，依次給予600 cGy、800 cGy、1000 cGy射線照射細胞，當累積劑量達到1200 cGy時篩選具有穩定放射抵抗性表型的乳腺癌細胞系MCF-7R，MCF-7R細胞進行常規培養，待細胞穩定傳代5代后進行后續實驗。

1.2.3 細胞照射、轉染及分組 人乳腺上皮細胞MCF-10A與乳腺癌MCF-7細胞、MCF-7R細胞培養于含10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養基，置于恒溫培養箱培養，取生長良好的細胞按照實驗要求用不同劑量的X射線照射，照射條件為100 cm的源靶距，10 cm×10 cm的照射野，5 Gy/min的劑量率。同時取生長狀態良好的MCF-7R細胞，胰蛋白酶消化細胞，調整細胞濃度為2×105個/ml，接種于6孔板，待細胞培養細胞濃度達到80%左右參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行轉染，將TUG1干擾表達質粒（TUG1 siRNA）及其陰性對照干擾質粒轉染至MCF-7R細胞，分別記為沉默TUG1組（si-TUG1）、沉默對照組（si-control）。將miR-214-5p mimics及其相應陰性對照分別轉染至MCF-7R細胞，分別記為過表達miR-214-5p組（miR-214-5p）、過表達miR-NC組（miR-NC），將miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）及其陰性對照分別與TUG1 siRNA共轉染至MCF-7R細胞，分別記為沉默TUG1+抑制miR-NC組（si+TUG1+anti-miR-NC）、沉默TUG1+抑制miR-214-5p組（si-TUG1+anti+miR-214-5p）。轉染前1 d將培養基更換為Opti-MEM減血清培養基，轉染6 h后棄轉染液并將細胞培養基更換為含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，繼續培養。轉染后48 h用4 Gy劑量照射各組細胞，照射48 h后檢測細胞凋亡。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測TUG1、miR-214-5p表達 用Trizol試劑盒提取乳腺癌組織及各組細胞總RNA，測定RNA濃度，利用反轉錄試劑盒合成cDNA，反轉錄體系共12 μl：2 μg RNA（根據RNA濃度計算加入體積），1 μl oligo（dT），4 μl反應緩沖液，1 μl RNase抑制劑，2 μl dNTP，1 μl逆轉錄酶，ddH2O補足至12 μl。反應程序設定為65℃5 min，42℃1 h，70℃5 min，反轉錄得到cDNA，將cDNA置于?20℃冰箱保存。按照實時熒光定量PCR試劑盒配置qRT-PCR反應體系，反應體系共20 μl：SYBR 10 μl，正反向引物各0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O補足至20 μl。置于實時熒光定量PCR儀檢測，反應程序設定為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共循環40次。采用2?ΔΔCt法計算TUG1與miR-214-5p的相對表達量。

1.2.5 細胞克隆實驗 收集各組MCF-7與MCF-7R細胞，胰蛋白酶消化細胞后接種于6孔板，分別用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細胞，實驗均設置3次重復，置于恒溫培養箱中培養，待細胞克隆生長出現細胞克隆團時，PBS洗滌10 min×3次，甲醇固定20 min，0.5%結晶紫染色15 min，置于顯微鏡下觀察有效克隆數，使用GraphPad Prism 7軟件單機多靶計算增敏比（SER），細胞克隆形成率=（有效克隆數/接種細胞）×100%，細胞存活分數=受照射細胞克隆形成率/對照細胞克隆形成率×100%。

1.2.6 細胞凋亡檢測 轉染后各組MCF-7R細胞經4 Gy劑量照射48 h，用預冷PBS洗滌細胞5 min×2次，加入1×Binding Buffer重懸細胞（100 μl），調整細胞密度（2×105個/ml），將195 μl細胞懸液加入檢測管內，依次分別加入Annexin V-FITC 5 μl，避光孵育15 min，用200 μl的1×Binding Buffer洗滌細胞，4℃條件下，1000 r/min離心3 min，用190 μl的1×Binding Buffer重懸細胞，加入10 μl PI，避光孵育15 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗 運用生物信息學數據庫對TUG1可能吸附的miRNA進行預測，結果發現TUG1可能吸附miR-214-5p，將含有miR-214-5p結合位點的TUG13'UTR序列及其突變體插入熒光素酶報告基因載體中得到TUG1-Wt、TUG1-Mut，同 時 將MCF-7R細 胞 以1×105個/孔 接 種 于24孔板，待細胞生長融合度達80%左右時將miR-214-5p mimic或miR-NC與TUG1-Wt、TUG1-Mut分別共轉染MCF-7R細胞，每組實驗均設置3個復孔。放入恒溫培養箱培養48 h后加入25 μl/孔1×Pas‐sive裂解緩沖液，室溫靜置15 min后以每孔加入20 μl裂解液的密度將其加入白板中，同時加入熒光素酶緩沖液（50 μl/孔），置于多功能酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性。加入Stop&Glo（50 μl/孔），于多功能酶標儀檢測海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值作為熒光素酶活性。

1.3 統計學處理 采用統計學軟件SPSS21.0分析數據，實驗數據以±s表示，兩組間數據比較經正態性檢驗，服從正態分布采用t檢驗，多組間比較經方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 放射抵抗的乳腺癌組織和細胞中TUG1高表達 qRT-PCR檢測放射敏感組與放射抵抗組患者乳腺癌組織中TUG1的表達水平。如圖1A所示，放射抵抗組患者乳腺癌組織中TUG1的表達水平較放射敏感組明顯升高（P<0.05）。細胞克隆形成實驗結果顯示，隨著照射劑量的增加，MCF-7R細胞的存活分數與MCF-7細胞比較明顯升高（P<0.05），見圖1B。單擊多靶模型參數值見表1，MCF-7R細胞增敏比（SER）為0.829。用qRT-PCR法進一步檢測人乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌MCF-7細胞、乳腺癌放射抵抗MCF-7R細胞中TUG1的表達水平，如圖1C所示，與MCF-10A相比，MCF-7細胞與MCF-7R細胞中TUG1的表達水平均明顯升高（P<0.05），與MCF-7細胞相比，MCF-7R細胞中TUG1的表達水平顯著升高（P<0.05）。

圖1 放射抵抗的乳腺癌組織和細胞中TUG1的表達Fig.1 TUG1 expression in radioresistant breast cancer tissues and cells

表1 乳腺癌MCF-7和MCF-7R細胞的單擊多靶模型參數值Tab.1 Parameter values of single-click multi-target model for breast cancer MCF-7 and MCF-7R cells

2.2 沉默TUG1增加MCF-7R細胞的放射敏感性

利用瞬時轉染技術將si-TUG1及其陰性對照轉染至乳腺癌MCF-7R細胞，qRT-PCR驗證轉染效率，如圖2A所示，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細胞中TUG1的表達水平較沉默對照組明顯降低（P<0.05），表明轉染成功。細胞克隆實驗檢測沉默TUG1后乳腺癌MCF-7R細胞的放射敏感性，結果顯示沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細胞存活分數較沉默對照組明顯降低，見圖2B，其中照射劑量為4 Gy時乳腺癌MCF-7R細胞存活分數出現顯著差異，因此后續實驗中以4 Gy照射細胞。沉默TUG1后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值見表2，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細胞增敏比（SER）為1.440，表明沉默TUG1后可明顯增加乳腺癌MCF-7R細胞放射敏感性。

表2 沉默TUG1后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值Tab.2 Parameter values of MCF-7R cell click multi-tar?get model after silencing TUG1

圖2 沉默TUG1對MCF-7R細胞放射敏感性的影響Fig.2 Effect of silencing TUG1 on radiosensitivity of MCF-7R cells

2.3 沉默TUG1促進放射照射誘導的MCF-7R細胞凋亡 轉染si-TUG1及其陰性對照后用4 Gy照射劑量照射MCF-7R細胞，分別為沉默對照+4Gy組、沉默TUG1+4Gy組。流式細胞儀檢測經4 Gy照射后MCF-7R細胞的凋亡情況，如圖3所示，與沉默對照組相比，沉默TUG1組、沉默對照+4Gy組MCF-7R細胞凋亡率均明顯升高（P<0.05），與沉默對照+4Gy組相比，沉默TUG1+4Gy組MCF-7R細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。表明沉默TUG1后可通過促進放射照射誘導的MCF-7R細胞凋亡進而增加乳腺癌細胞放射敏感性。

圖3 沉默TUG1對輻射照射后MCF-7R細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of silencing TUG1 on apoptosis of MCF-7R cells after radiation exposure

2.4 TUG1可吸附并調控miR-214-5p的表達 靶基因網站預測TUG1可能吸附的miRNA，結果發現TUG1可能靶向調控miR-214-5p，TUG1與miR-214-5p存在互補結合核苷酸位點，見圖4A。通過雙熒光素酶報告基因實驗探討TUG1是否可以直接靶向miR-214-5p，結果顯示，與過表達miR-NC組相比，miR-214-5p過表達能夠明顯抑制野生型TUG1-Wt的熒光素酶活性（P<0.05），TUG1與miR-214-5p結合位點突變后，miR-214-5p過表達對突變型TUG1-Mut的熒光素酶活性無明顯抑制效果（P>0.05），見圖4B。qRT-PCR檢測結果顯示，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細胞中miR-214-5p的表達水平較沉默對照組明顯升高（P<0.05），見圖4C。表明TUG1可靶向吸附miR-214-5p而抑制其表達。

圖4 TUG1可調控miR-214-5p的表達Fig.4 TUG1 can regulate expression of miR-214-5p

2.5 過表達miR-214-5p增加MCF-7R細胞的放射敏感性 qRT-PCR檢測miR-214-5p在人乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌MCF-7、MCF-7R細胞中的表達水平，結果顯示，與MCF-10A細胞相比，MCF-7、MCF-7R細胞中miR-214-5p表達水平均明顯降低（P<0.05），與MCF-7細胞相比，MCF-7R細胞中miR-214-5p的表達水平明顯降低（P<0.05），表明miR-214-5p表達水平的降低可能降低乳腺癌細胞放射敏感性（圖5A）。將miR-214-5p mimics及其陰性對照轉染至MCF-7R細胞，qRT-PCR驗證轉染效率，結果顯示，過表達miR-214-5p組MCF-7R細胞中miR-214-5p的表達水平明顯高于過表達miR-NC組（P<0.05，圖5B）。細胞克隆形成實驗結果顯示，隨著照射劑量的增加，過表達miR-214-5p組MCF-7R細胞存活分數較過表達miR-NC組明顯降低（P<0.05，圖5C），過表達miR-214-5p后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值見表3，過表達miR-214-5p組MCF-7R細胞增敏比（SER）為1.455。表明miR-214-5p過表達可增強乳腺癌細胞敏感性。流式細胞術檢測miR-214-5p過表達后MCF-7R細胞凋亡情況，結果顯示，與過表達miR-NC組相比，過表達miR-214-5p組與過表達miR-NC+4Gy組MCF-7R細胞凋亡率均明顯增加（P<0.05），與過表達miR-NC+4Gy組相比，過表達miR-214-5p+4Gy組MCF-7R細胞凋亡率明顯增加（P<0.05），見圖5D。表明miR-214-5p過表達可通過促進放射誘導的乳腺癌細胞凋亡進而增加細胞放射敏感性。

表3 過表達miR-214-5p后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值Tab.3 MCF-7R cell click multi-target model parameter values after overexpression of miR-214-5p

圖5 過表達miR-214-5p對MCF-7R細胞放射敏感性的影響Fig.5 Effect of miR-214-5p overexpression on radiosensi?tivity of MCF-7R cells

2.6 抑制miR-214-5p可逆轉沉默TUG1對MCF-7R細胞放射敏感性的影響 將si-TUG1與miR-NC共轉染至MCF-7R細胞，si-TUG1與miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）共轉染至MCF-7R細胞，以驗證TUG1是否通過抑制miR-214-5p表達進而降低乳腺癌細胞放射敏感性，細胞克隆形成實驗結果顯示，沉默TUG1+抑制miR-214-5p組MCF-7R細胞存活分數較沉默TUG1+抑制miR-NC組明顯升高（P<0.05），見圖6B。抑制miR-214-5p聯合沉默TUG1后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值見表4，沉默TUG1+抑 制miR-214-5p組MCF-7R細 胞 增 敏 比（SER）為0.713，相較于沉默TUG1組明顯降低。表明抑制miR-214-5p可逆轉沉默TUG1對MCF-7R細胞放射敏感性的增強作用。流式細胞術檢測結果顯示，沉默TUG1+抑制miR-214-5p組MCF-7R細胞凋亡率較沉默TUG1+抑制miR-NC組明顯降低（P<0.05），見圖6C。表明抑制miR-214-5p可逆轉沉默TUG1對放射誘導的乳腺癌細胞凋亡的促進作用。

圖6 抑制miR-214-5p聯合沉默TUG1對MCF-7R細胞放射敏感性及放射誘導的細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-214-5p combined with silencing TUG1 on radiosensitivity of MCF-7R cells and ra?diation-induced apoptosis

表4 抑制miR-214-5p聯合沉默TUG1后MCF-7R細胞單擊多靶模型的參數值Tab.4 Inhibition of miR-214-5p combined with silencing TUG1 in MCF-7R cells by clicking multi-target model parameter values

3 討論

乳腺癌的治療方式中放療技術應用較為廣泛，在一定程度上可延長乳腺癌患者生存期，但由于患者體質或病理程度不同導致放療效果相差較大，部分患者甚至出現放療抵抗性，因此如何通過增強腫瘤細胞放射敏感性成為提高乳腺癌患者臨床治療效果的重要切入點[8］。研究表明長鏈非編碼RNA BRCA1相鄰基因2（LncRNA NBR2）在放射誘導的乳腺癌細胞中呈低表達，上調LncRNA NBR2表達可通過抑制乳腺癌細胞增殖能力進而增強腫瘤細胞的放射敏感性[9］。近年來，研究發現部分LncRNA異常表達與乳腺癌細胞放療敏感性有關，并可能作為腫瘤細胞放療抵抗的預測因子[10］。但仍有部分LncRNA與乳腺癌細胞放療敏感性的相關性研究尚未明確，需進一步深入挖掘LncRNA并探討其與乳腺癌細胞放射敏感性的關系，為提高臨床治療效果提供參考。

TUG1在多種惡性腫瘤進展中均具有重要調控作用，研究表明TUG1在乳腺癌中呈高表達，其表達水平與乳腺癌患者腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結轉移等呈正相關，TUG1表達可能通過下調p27表達進而促進乳腺癌生長[11］。肺腺癌組織中TUG1表達上調，其高表達與患者惡性臨床病理特征密切相關，TUG1可能通過抑制p16表達促進肺腺癌的發生發展[12］。提示TUG1可能作為腫瘤診斷及治療的重要分子標志物。張桓瑜等[13］研究表明，TUG1在神經母細胞瘤細胞中呈高表達，并可促進腫瘤細胞遷移及侵襲。越來越多的研究表明，TUG1可通過充當競爭性內源性RNA吸附miRNA或與RNA結合蛋白相互作用進而調控靶基因表達，最終影響癌癥發生及發展過程，TUG1可能作為腫瘤診斷及評估患者預后的重要生物標志物及治療靶點基因[14］。ZHAO等[15］研究表明TUG1可通過充當miR-382的海綿進而促進胰腺癌細胞增殖、遷移及EMT過程。LEI等[16］研究表明TUG1可通過靶向調控miR-145影響乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、遷移及EMT過程。本研究結果表明，乳腺癌細胞中TUG1的表達水平明顯高于乳腺上皮細胞，而放射抵抗性乳腺癌MCF-7R細胞中TUG1的表達水平較乳腺癌細胞明顯升高，說明TUG1的表達水平升高可降低乳腺癌細胞放射敏感性。本研究通過沉默TUG1表達，發現MCF-7R細胞存活分數明顯降低，細胞增敏比明顯升高，說明沉默TUG1表達可增加乳腺癌細胞放射敏感性，提示TUG1可能作為乳腺癌靶向治療的潛在靶點。本研究同時發現，沉默TUG1表達后經X射線照射后乳腺癌細胞凋亡率明顯升高，說明沉默TUG1表達可通過促進乳腺癌細胞凋亡進而增加乳腺癌細胞放射敏感性。提示TUG1高表達可通過抑制放射誘導的乳腺癌細胞凋亡進而降低細胞放射敏感性。

miR-214-3p在宮頸癌細胞中呈高表達，上調miR-214-3p表達后可促進宮頸癌細胞增殖，抑制miR-214-3p表達后可抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，為宮頸癌臨床診斷及治療提供新靶點[17］。研究表明miR-214-5p在胰腺癌細胞中呈低表達，上調miR-214-5p表達可抑制胰腺癌細胞遷移及侵襲[18］。LI等[19］研究表明miR-214-5p過表達可抑制肝細胞癌細胞遷移及侵襲。miR-214-5p可靶向抑制ROCK1表達進而抑制人骨肉瘤細胞增殖及侵襲[20］。本研究發現乳腺癌細胞中miR-214-5p的表達水平明顯升高，其在乳腺癌放射抵抗細胞中的表達水平較乳腺癌細胞明顯降低，說明miR-214-5p表達水平與乳腺癌細胞放射敏感性密切相關。通過將miR-214-5p mimics轉染入放射抵抗乳腺癌MCF-7R細胞以提高miR-214-5p的表達水平，結果發現miR-214-5p過表達可明顯降低MCF-7R細胞存活分數，促進MCF-7R細胞凋亡，增加乳腺癌細胞放射敏感性。提示miR-214-5p過表達可明顯增加乳腺癌細胞放射敏感性。雙熒光素酶報告實驗證實TUG1可吸附miR-214-5p而降低其表達，為驗證其是否通過調控miR-214-5p表達降低乳腺癌細胞放射敏感性，將沉默TUG1與抑制miR-214-5p共轉染至MCF-7R細胞，結果發現共轉染后MCF-7R細胞存活分數明顯增加，增敏比明顯降低，細胞凋亡率明顯降低。提示沉默TUG1可通過上調miR-214-5p表達進而增加乳腺癌細胞放射敏感性。

綜上所述，TUG1在乳腺癌細胞中高表達，沉默TUG1可通過上調miR-214-5p表達而促進乳腺癌細胞凋亡并增加細胞株放射敏感性。但TUG1在乳腺癌細胞增殖、放療抵抗及凋亡中的具體作用機制尚需深入研究。