澤瀉湯加味方對鹽敏感性高血壓Dahl大鼠腎臟NADPH氧化酶表達的影響?

張婷婷， 吳鑫宇， 陸雪健， 滕 堯， 張樹峰， 蔣希成△

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040； 2.寧波大榭開發區醫院， 浙江 寧波 315800；3.承德醫學院， 河北 承德 067000)

《黃帝內經》中有“咸者，脈弦也”和“咸傷腎”的記載，對鹽與血壓及腎臟的關系有所闡述?！吨袊哐獕悍乐沃改?第三版)》提出食鹽攝入量與高血壓發生密切相關，高血壓中鹽敏感性高血壓 (salt-sensitive hypertension，SSH)占60%[1]。SSH是由高鹽攝入引起的血壓升高，其發生與生理、環境、人口和遺傳因素有關，腎的水鈉代謝障礙與內皮功能障礙被認為是SSH發生的主要機制[2]。

現代研究表明，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH氧化酶)是血管緊張素II(AngiotensinII, AngII)對血壓和血管炎癥反應的關鍵決定因素。NOX4是NADPH氧化酶主要在腎臟表達的亞型，p22phox、p47phox是NADPH氧化酶的亞基。實驗研究表明，調控NADPH氧化酶亞基的表達對調控血壓及腎保護具有重要意義。本實驗通過高鹽飲食誘導SSH動物模型，研究澤瀉湯加味方對腎臟NOX4、p22phox和p47phox表達的影響，分析其對血壓的調控與腎臟的保護機制。本研究已通過黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理學批準號2016050601。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性4周齡Dahl大鼠60只，體質量80～100 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK(津)2012-0001。飼養于黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心，環境溫度(20±2)℃，相對濕度(40～42)%，各組大鼠自由覓食飲水，規律光照。

1.2 飼料及造模

8%NaCl高鹽純化飼料(批號16030601(A2)，購自開源動物飼料(常州)有限公司；正常飼料(SPF級)購自北京科奧協力飼料有限公司)。除空白對照組給予正常飼料外，其余5組均給予8 %NaCl高鹽純化飼料，喂養4周后造模。經過4周造模成功給予正常飼料。

1.3 藥物

澤瀉湯加味方組成：澤瀉21 g，麩炒白術9 g，澤蘭15 g，石菖蒲15 g，購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥飲片局。

1.4 分組及給藥

60只Dahl大鼠隨機分為空白對照組、模型組、纈沙坦組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組6組各10只。澤瀉湯加味方前期研究選用L9(34)正交表，得出組方最佳配比[3]，濃縮制成濃度為1∶1水煎劑，根據人與大鼠給藥劑量比例進行等效轉換，中藥低劑量組5.4 g·kg-1·d-1灌胃，中藥中劑量組10.8 g·kg-1·d-1灌胃，中藥高劑量組21.6 g·kg-1·d-1灌胃，纈沙坦組給予纈沙坦7.2 mg·kg-1·d-1灌胃，空白對照組及模型組給予等體積5% CMC-Na溶液灌胃，每日1次連續給藥4周。

1.5 主要試劑與儀器

纈沙坦(批號H20040217)，北京諾華制藥有限公司；phox-p22抗體(bs-3879)，美國Bioss公司；phox-p47抗體(bs-6966)，美國Bioss公司；NOX4抗體(14347-1)，武漢三鷹生物技術有限公司；NC膜，美國 Millipore公司；PBS磷酸鹽緩沖，北京博奧拓科技有限公司；二甲苯，天津永大化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、戊二醛、水合蘇木素、無水乙醇、95 %乙醇，天津市福晨化學試劑廠。

BP-6動物無創血壓測試儀、BP-420F通用4通道生物機能系統(成都泰盟科技有限公司)；2135型組織切片機、EMUC7超薄切片機(德國Leica公司)；TECNAI G2透射電鏡(美國FEI公司)；ABI7500熒光定量PCR儀、Multiskan MK3酶標儀、Nano Drop 2000分光光度計 (美國Thermo公司)；電泳儀、半干槽(美國Bio-Rad公司)；Tanon 1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；Mini P-4電泳槽、濕轉電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)；水平脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)等。

1.6 體質量及血壓測量

造模成功后，各組大鼠于給藥前和給藥1、2、3、4周末各測定1次體質量和血壓。采用無創尾套法測定清醒大鼠尾部收縮壓(SBP)，每次灌藥后2 h開始測量SBP，記錄3次并取平均值。

1.7 腎臟標本采集及固定

10 %水合氯醛腹腔內給藥麻醉，取大鼠雙側腎臟稱重，計算腎重/體質量指數，用刀片自腎門處冠狀切面對半剖開，一部分放入95 %乙醇中，過碘酸-雪夫氏(PAS)染色，中性樹膠封固，每組選取4個標本(× 400)，光鏡下觀察腎臟病理組織形態改變。另取部分腎組織置于3 %戊二醛中，乙醇脫水丙酮包埋，每組選取4個標本(×20000)，在透射電鏡下觀察腎臟病理組織超微結構變化。其余腎組織剖開后裝入5 mL凍存管，立即放入液氮凍存，用于蛋白及mRNA檢測備用。

1.8 Western blot 檢測p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達

將腎組織剪碎進行總蛋白提取，預冷RIPA蛋白抽提試劑加入蛋白酶抑制劑。細胞計數，以細胞數量1×107加入1 ml裂解液，冰上孵育20 min，4 ℃ 13000 rpm離心20 min，取上清分裝保存待測。進行核蛋白提取，充分混勻后冰上放置40 min，1 4000 rpm4 ℃離心15 min，上清即為胞核蛋白。應用 BCA法蛋白定量酶標儀讀取OD值。以RIPA調整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液后樣品終濃度煮沸變性5 min。根據目的蛋白p22phox、p47phox和NOX4的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5 %，10 μg每孔上樣，通過預染蛋白Marker 確定電泳停止時間，然后進行轉膜和染色并觀察轉膜效果。用3 % BSA-TBST稀釋p22phox、p47phox和NOX4蛋白，濃度為1∶500，內參蛋白GAPDH濃度為1∶2000，室溫孵育10 min，4 ℃過夜封閉。第2天膜處理后曝光，顯影2 min定影，拍照保存圖像，分析軟件測定條帶光密度值，以光密度值代表蛋白的相對表達量。

1.9 RT-PCR檢測p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達

采用Trizol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作按產品說明書進行，把組織放入已預冷的研缽中進行研磨處理備用。用紫外吸收測定法檢測濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳制膠，準備RNA樣品進行電泳，進行紫外透射光下觀察并拍照，對RNA質量進行檢測。表1示，設計p22phox、p47phox和NOX4 mRNA引物，采用 GAPDH 作內參。實驗操作嚴格按產品說明書進行擴增，逆轉錄合成cDNA，60～95 ℃進行融解曲線分析，儀器自動繪制出對應的內參基因和目的基因標準曲線。將所有的cDNA樣品分別配置RT-PCR反應體系，混合溶液5000 rpm短暫離心，加樣后進行PCR反應。各樣品的目的基因和內參分別進行反應，每個樣本檢測3個復孔，數據采用2-△△ CT法進行分析。

表1 RT-PCR各基因引物序列

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 各組不同時間SBP

表2示，與空白對照組比較，模型組給藥前和給藥1、2、3、4周后SBP升高(P<0.05)，提示造模成功；與模型組比較，纈沙坦組給藥2、3、4周后SBP降低 (P<0.05)，中藥高、中、低劑量組給藥3、4周后SBP降低(P<0.05)。

表2 各組Dahl大鼠不同時間SBP變化比較

2.2 各組大鼠體質量、腎重、腎重/體質量

表3示，與空白對照組比較，模型組腎重、腎重/體質量升高 (P<0.05)；與模型組比較，中藥中劑量組腎重、腎重/體質量降低(P<0.05)，各組間體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組Dahl大鼠干預4周體質量、腎重、腎重/體質量變化比較

2.3 腎臟病理組織學變化

2.3.1 PAS染色觀察腎臟病理組織形態 PAS染色下纈沙坦組及中藥高、中、低劑量組腎臟病理組織改變較模型組輕，以中藥中劑量組明顯。圖1示，空白對照組腎小球大小和結構基本正常，未見明顯深染區域呈弱染色。模型組大鼠腎小球體積明顯增大且呈分葉狀，系膜細胞增生，PAS陽性物質增多深染，間質增生。與模型組比較，纈沙坦組和各中藥組腎小球體積減小，PAS陽性物質減少，基底膜增厚減輕。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.纈沙坦組；d.中藥低劑量組；e.中藥中劑量組；f.中藥高劑量組

2.3.2 透射電鏡觀察腎臟病理組織超微結構變化 透射電鏡下，纈沙坦組及各中藥組腎臟病理組織超微結構改變較模型組輕，腎小球、腎小管結構完整度好于模型組。圖2示，空白對照組腎小球可見毛細血管內皮細胞呈扁平梭形，粗面內質網、線粒體等結構完整，基底膜連續完整，結構清晰完整，足細胞未見異常；腎小管上皮細胞未見腫脹，細胞器結構完整。模型組腎小球基底膜結構界限不清晰并有破壞，膜腫脹不均，增厚變硬明顯增生，線粒結構破壞，可見足細胞融合；腎小管細胞核內染色質邊集，胞內溶酶體增多變性，線粒體亦出現腫脹及嵴結構消失呈空泡變性。纈沙坦組及各中藥組可見腎小球少量基底膜呈節段性增厚，但膜結構連續足突基本正常，系膜細胞及基質未見明顯增生，細胞內細胞器結構好于模型組，線粒體腫脹但嵴結構存在；部分腎小管可見胞質內溶酶體增多，其余部分未見明顯異常。

注：a.空白對照組；b.模型組；c.纈沙坦組；d.中藥低劑量組；e.中藥中劑量組；f.中藥高劑量組

2.4 澤瀉湯加味方對p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達的影響

圖3表4示，與空白對照組比較，模型組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達升高 (P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及各中藥組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達降低，中藥中劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組Dahl大鼠腎組織p22phox、p47phox和NOX4 蛋白表達

圖3 各組腎組織p22phox、p47phox和NOX4 蛋白免疫印跡圖

2.5 澤瀉湯加味方對p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達的影響

表5示，與空白對照組比較，模型組p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達升高 (P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及各中藥組p22phox、p47phox和NOX4蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 各組Dahl大鼠腎組織p22phox、p47phox和NOX4 mRNA表達比較

3 討論

澤瀉湯加味方具有利水泄濁、健脾化痰、活血化瘀之功效。中醫理論認為，上述4味藥合煎共奏利水泄濁、祛痰開竅之功效。SSH屬于中醫水濕內停、痰濁壅盛之證?！毒霸廊珪つ[脹》闡明了腎臟是水腫病之本，腎氣對參與水液代謝臟腑有一定的促進作用，最終將各臟腑形體官竅代謝后所產生的濁液下輸于腎及膀胱，在腎氣的蒸化作用下分為清濁，清者再次參與水液代謝，濁者為尿液排出體外，腎氣與肺、脾、三焦共同協同運化水液?，F代藥理研究表明，利尿劑為治療高血壓的重要藥物，澤瀉湯加味方的降壓作用可能與其利水泄濁功效密切相關。

腎臟既是血壓調節的重要器官，同時又是高血壓損害的主要靶器官之一。Dahl大鼠是一種具有高血壓遺傳特性的近交系大鼠，這種品系的大鼠對鹽負荷敏感，此類動物模型能復制出臨床對鹽敏感患者的情況。近期研究表明，鹽、AngII和活性氧(reactive oxygen species，ROS)可促進慢性腎臟疾病的進展，且驗證高鹽攝入會產生特定的ROS。病理情況下，ROS過表達可引起細胞氧化損傷，如腎小球系膜細胞增殖，腎小管血管內皮功能障礙或損傷，血管壁中膜肥厚，腎纖維化及出現炎癥反應，發生腎損害性高血壓[4]。NADPH 氧化酶抑制劑可有效抑制大鼠腎組織中 ROS 的產生，減少蛋白尿并改善腎組織病理改變[5]。

NADPH氧化酶家族有7個亞型，NOX4是腎臟較高表達的亞型，通過激活多種信號通路參與高血壓腎病等腎臟疾病的氧化還原過程。研究表明，AngII-NADPH-ROS 信號通路的活化在SSH中發揮關鍵作用[6，7]。NADPH氧化酶被激活后，通過p47phox的絲氨酸磷酸化，然后與p67phox形成復合物，移位到細胞膜與p22phox結合形成具有活性的NADPH氧化酶復合物[8]。有研究證實，抑制p47phox可以減輕氧化應激，降低高血壓和心血管重塑的發生[9]。p22phox在體內外缺氧反應中的調控作用與ROS生成有關，并對血壓的調節起關鍵作用，大腦穹下器官中NADPH氧化酶可以通過p22phox調節血壓和血管炎癥[10，11]。研究表明，NADPH氧化酶抑制劑治療相關疾病具有重要的研究意義，雷公藤紅素和紅杉醇分別可以抑制p47phox、p22phox位點，進而特異性地抑制NOX4的表達[12，13]。因此，抑制NADPH氧化酶的相關分子表達阻斷激活ROS可以成為治療SSH的思路。

本研究結果顯示，高鹽飲食誘導高血壓動物模型復制成功。澤瀉湯加味方干預治療3周后血壓顯著下降，隨著治療時間的增加血壓持續下降，證明中藥澤瀉湯加味方具有降低Dahl大鼠SBP的功效。中藥中劑量組大鼠腎重及腎重/體質量顯著降低，說明澤瀉湯加味方能降低腎負荷。觀察腎臟病理組織形態，PAS染色可見各中藥組大鼠腎小球體積、系膜細胞及基底膜結構較好于模型組大鼠。透射電鏡下觀察超微結構變化，各中藥組大鼠腎小球基底膜、線粒體結構及腎小管上皮細胞均優于模型組大鼠，表明澤瀉湯加味方能明顯改善大鼠腎臟病理組織學改變，具有腎保護作用。前期研究表明，澤瀉湯加味方能夠減少模型大鼠血清尿素氮、血肌酐的含量[14]。綜上結果證實，澤瀉湯加味方具有降低血壓和腎保護作用。

澤瀉湯加味方能下調大鼠腎臟組織中p22phox、p47phox和NOX4蛋白及mRNA的表達，中藥中劑量組對蛋白的表達下調作用明顯，中藥3個劑量組均對mRNA的表達下調作用顯著。其作用機制可能為澤瀉湯加味方抑制Dahl大鼠腎臟組織中的NADPH氧化酶NOX4活化，通過抑制p47phox的磷酸化，影響p22phox結合形成有活性的NADPH 氧化酶復合物，進而抑制ROS的產生。AngII-NADPH-ROS通路是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的相關信號通路，其異常被認為是SSH發生的重要機制之一，其中NADPH氧化酶介導的ROS在高血壓中樞神經系統信號傳導中具有重要作用[15]。ROS在腎臟疾病發生發展中具有重要作用，腎小球中主要的ROS產生者是p47phox亞單位，作為關鍵調節因子其表達和磷酸化在腎損傷過程中的上調已被證實會加重腎損傷[16]。實驗組已證實，澤瀉湯加味方能顯著減低大鼠腎小球系膜細胞HBZY21的ROS 表達水平[7]，可知澤瀉湯加味方能通過下調ROS表達發揮腎臟保護作用。本研究中，澤瀉湯加味方可能通過抑制p22phox、p47phox和NOX4的表達，抑制ROS的產生，通過阻斷NADPH氧化酶信號傳導，進而起到降低血壓和腎保護作用。此作用機制可為澤瀉湯加味方臨床治療SSH提供分子依據。