電針“曲池”“陽陵泉”、加味芍藥甘草湯及針?biāo)幗Y(jié)合三種方法對SCA模型大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB影響的比較研究?

郭 斌， 馬逸杰， 楊 舟△， 岳增輝△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，長沙 410021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

腦卒中肢體痙攣狀態(tài)是一種以肢體偏癱為表現(xiàn)的運動功能性障礙狀態(tài),腦卒中發(fā)生后神經(jīng)元大量死亡，從而引起突觸結(jié)構(gòu)的破壞最終發(fā)生一定的神經(jīng)功能損傷[1]，使患者的生活質(zhì)量受到較大影響[2]。腦卒中發(fā)生時大腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子廣泛參與腦卒中的發(fā)生過程，其主要參與受損突觸結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，是神經(jīng)損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)功能恢復(fù)的重要影響因素[3]。

對腦卒中肢體痙攣狀態(tài)的治療中醫(yī)各家有不同的方法[4]?！栋侔Y賦》中記載：“半身不遂，陽陵遠(yuǎn)達(dá)于曲池?！鼻仄礁螡撽柖顑?nèi)風(fēng)，陽陵泉舒筋活絡(luò)抑肝風(fēng)，二者配伍調(diào)達(dá)氣機，強筋健骨[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“曲池”“陽陵泉”可以調(diào)節(jié)各組神經(jīng)遞質(zhì)，從而緩解腦卒中肢體痙攣及肌張力緊張的癥狀[6，7]?！秱摗飞炙幐什轀浴八岣驶帯闭撝危菇蠲}得陰津濡潤,從而解除痙攣，改善肌張力[8]。本團隊通過臨床觀察得出針灸與中藥配合使用，能更好地緩解腦卒中后偏癱患者肌張力,改善運動功能,提高日常生活活動能力[9]。本研究擬通過實驗觀察電針、中藥以及針?biāo)幗Y(jié)合3種治療方法，對CSA大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB的干預(yù)效應(yīng)，分析遴選最適宜該疾病的治療方法。本研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，實驗動物批號20171103。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康成年SD雄性大鼠77只，7周齡，體質(zhì)量(240±30)g，由湖南斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司提供，實驗動物使用許可證號SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，普通飼料投喂，室溫(25±2)℃，相對濕度65%～70%，自然光照，自由進食飲水。

1.2 藥物

加味芍藥甘草湯組成：白芍30 g，甘草10 g，黃芪30 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山萸肉10 g，枸杞10 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，地龍10 g，雞血藤15 g，木瓜10 g，水煎劑，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，均由王竹鑫主任鑒定，先按比例配方取藥，然后將飲片以蒸餾水浸泡1 h ,繼以武火急煎至沸騰, 再以文火煎煮2 h , 取汁后以四層紗布過濾；藥渣再加蒸餾水文火煎煮 1 h ,過濾取汁，2次藥汁合并,將藥物濃縮至含生藥10 mL·kg-1。

1.3 主要試劑與儀器

N-甲基-D-天冬氨酸受體(美國Sigma公司，貨號M3262)；PVDF轉(zhuǎn)GAT-1(美國millipore公司，貨號IPVH00010)；化學(xué)發(fā)光試劑(美國millipore公司，貨號WBKLS0010)；β-Actin(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號PAB36265)；BDNF(英國abcam公司，ab108319)；TrkB(英國abcam公司，ab18987)；GoatAnti-RabbitIgG(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號PAB160011)；SYBRGreenPCR試劑盒(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號KM4101)；PBS 磷酸鹽緩沖液(Bioswamp武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號PAB180003)。

H7650型透射電鏡(日本日立高新科技公司);SN-2型大鼠腦立體定位儀(日本成茂公司);SDZ-V型電子電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);5ul型微量注射器(上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司);CFX-Connect96型熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司);針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,0.30×13 mm);miniprotean3cell型電泳儀(美國Bio-Rad公司);MD1000型正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);Tanon-5200型全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司);Centrifuge5424R型離心機(德國Eppendorf公司);Nano-300型超微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及制備

將大鼠通過2次隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、假手術(shù)組、電針組、中藥組、和針?biāo)幗M6組各9只。采用改良Zea-longa線栓法+內(nèi)囊注射NMDA受體法制作腦卒中肢體痙攣大鼠模型[10]。麻醉成功后仰臥位備皮、消毒，頸部正中偏右做切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈迷走神經(jīng)，向上暴露頸總動脈分叉處、頸內(nèi)動脈與頸外動脈；各自結(jié)扎頸外動脈近心端、頸總動脈遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈；頸總動脈分叉膨大5 mm處做一小切口，栓線經(jīng)切口插入頸內(nèi)動脈，松開動脈夾深度約18～20 mm感到阻力停止插線；完畢后，將頸內(nèi)動脈近心端和栓線一起結(jié)扎逐層縫合；大鼠清醒后納入Zea-Longa評分1～3分的大鼠第2天再行內(nèi)囊注射NMDA受體法[11]。經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，NMDA與腦卒中肢體痙攣關(guān)系極為密切，大腦注射NMDA受體的實驗可行性強[12]；反復(fù)摸索濃度后確定為將5 mg NMDA受體溶于5 mL滅菌生理鹽水中，制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，37 ℃孵箱中孵育7 d，凝聚狀態(tài)備用[13，14]。繼續(xù)麻醉俯臥固定大鼠腦立體定位儀上備皮、消毒，逐層分離暴露前囟、額骨和右側(cè)頂骨交界骨縫；《大鼠立體定位圖譜》確定內(nèi)囊位置(前囟后1.4 mm，矢狀縫右側(cè)2.4 mm)[15]，在顱板上鉆一直徑約2 mm小孔，將微量注射器垂直插入7 mm，以1 μL/min速度注射NMDA受體，完畢后明膠海棉小心壓迫止血、消毒并縫合。

2次術(shù)后傷口均給予青霉素抗感染；按0.1 mg·kg-1劑量腹腔注射速尿，防止顱內(nèi)水腫；葡萄糖水及飼料喂養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)并保持呼吸道通暢。

2.2 各組大鼠處理方法

2.2.1 電針組 以解剖學(xué)知識為基礎(chǔ)，根據(jù)郭義[16]主編的《實驗針灸學(xué)》“動物針灸穴位圖譜”進行穴位定位。曲池：橈骨近端關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中，直刺3 mm。陽陵泉：距足三里(大鼠膝關(guān)節(jié)下側(cè)腓骨小頭下約3 mm)上外側(cè)5 mm，直刺3 mm。大鼠仰臥位束縛常規(guī)消毒，常規(guī)針刺捻轉(zhuǎn)角度90～180°，頻率60～90次/min，持續(xù)1 min，選用SDZ-V電針治療儀密波，100 Hz，電流強度1～3 mA。因為卒中后兩側(cè)肢體的肌張力及神經(jīng)損傷情況不同，且取穴原理為上下同施[17]，故未采用主調(diào)節(jié)全身功能性疾病的穴位局部刺激[18]及水平兩側(cè)穴位連接電極[19]，而是正極接在肢體一側(cè)的陽陵泉穴毫針針柄，負(fù)極接同側(cè)曲池針柄形成剌激回路[20]，以大鼠肢體輕微抖動為度，每日1次，每次30 min，連續(xù)5 d。

2.2.2 中藥組 先按比例配方取藥，然后將飲片以蒸餾水浸泡1 h ,將藥物濃縮至含生藥10 g·ml-1。將制備好的加味芍藥甘草湯水煎劑溫?zé)幔瑒┝堪凑粘扇肆繐Q算成動物劑量，灌胃容積為10 mL·kg-1體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)5 d。

2.2.3 針?biāo)幗M 先行中藥灌胃，每天1次；30 min后再行電針治療，每次30 min，每日1次，連續(xù)5 d。

2.2.4 其他組 造模時，假手術(shù)組只做分離，不結(jié)扎不插線。各組術(shù)后青霉素80萬U/d肌肉注射，共4 d。治療時，除空白組外均同電針組一樣束縛30 min，均同藥物組等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)5 d。

2.3 動物行為學(xué)檢測

表1示，5 d治療后依據(jù)Zea-longa[21]神經(jīng)功能評分表進行評分，將大鼠置于干凈的空鼠籠中任由其自由運動，每只觀察1 min并進行相應(yīng)的視頻記錄。

表1 Zea-longa神經(jīng)功能評分比較

2.4 取材方法

行為學(xué)評分后各組大鼠禁食不禁水18 h，水合氯醛(10%，3 mL·kg-1)腹腔注射進行麻醉后，麻醉斷頭冰盤上取患側(cè)海馬區(qū)，取一部分切成體積為1 mm3左右大小的米粒狀，置于2% 戊二醛混合固定液固定供電鏡檢測；其余部分置于凍存管內(nèi)放液氮中迅速降溫1 d，隨后放入-80 ℃冰箱儲存供PCR和WB檢測。

2.5 電鏡觀察各組大鼠海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化

脫水、滲透、包埋后制成70 nm的超薄切，行醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，H7650透射電鏡觀察并采集照片。

2.6 RT-PCR檢測大腦海馬區(qū)BDNF、TrkBmRNA的表達(dá)

采用Trizol 提取組織樣本中總RNA，使用PCR儀將1ug總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。表2示，各樣品目的基因和內(nèi)參基因引物序列。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃2 min，95 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃ 30 s，40 循環(huán),數(shù)據(jù)采用儀器自帶qbase plus軟件分析熒光CT值，按照 2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的mRNA相對定量結(jié)果。

表2 引物設(shè)計

2.7 WB檢測大腦海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)

提取25 μg 蛋白進行 10% SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF) 上，5%脫脂牛奶封閉 1 h，分別加入稀釋的一抗(BDNF 1∶2000；Trkb 1∶2000；β-actin 1∶2000)后 4 ℃ 孵育過夜，洗滌后滴加稀釋的二抗(1 ∶ 10000) 室溫孵育30 min，洗滌后 ECL 化學(xué)發(fā)光液孵育1 min，使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，利用Tanon-4100 GIS3.0軟件獲取相關(guān)條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

行為學(xué)測試結(jié)果表明，與空白組比較，模型組神經(jīng)功能評分增高(P<0.01)，提示模型構(gòu)建成功；與模型組比較，各治療組評分均有明顯下降(P<0.05)。

表3 6組大鼠神經(jīng)損傷情況比較{M(Q)}

3.2 電鏡觀察各組大鼠海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)變化

圖1示，電鏡下觀察與空白組比較，模型組突觸數(shù)量減少明顯，囊泡數(shù)量減少，突觸后細(xì)胞終末胞質(zhì)變性溶解顯著，突觸后致密帶密度下降，前后膜發(fā)生融合，間隙界限模糊;與模型組比較，各治療組的突觸數(shù)量明顯增多且相對密集，囊泡數(shù)量增多，新生的凹形突觸增加，突觸后致密物增厚，間隙規(guī)則緊致，說明各治療組均可對神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的修復(fù)重塑作用。而3組治療組中，針?biāo)幗M突觸結(jié)構(gòu)改善最佳。

注：A.突觸小體；B.突觸前膜；C.突觸后膜；D.突觸間隙.E.突觸小泡

3.3 各組大鼠大腦海馬區(qū)BDNF、TrkBmRNA表達(dá)比較

表4示，模型組與空白組比較，BDNF、TrkB mRNA的表達(dá)均降低(P<0.01)；而電針組、中藥組及針?biāo)幗M與模型組比較，BDNF、TrkB mRNA的表達(dá)均升高(P<0.05)，針?biāo)幗M升高最明顯(P<0.01)。

表4 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkBmRNA表達(dá)比較

3.4 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)影響

圖2表5示，模型組與空白組比較，BDNF、TrkB蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；而模型組與電針組、中藥組及針?biāo)幗M比較，BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)均有升高(P<0.05)，針?biāo)幗M升高最明顯(P<0.01)。

表5 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組大鼠大腦海馬區(qū)內(nèi)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)條帶

4 討論

BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布的一種促進神經(jīng)生長活性的堿性蛋白質(zhì)，主要作用于神經(jīng)元的存活、分化、生長和發(fā)育，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。TrkB是BDNF信號傳導(dǎo)通路上高度親和的配體，TrkB是激活下游信號傳導(dǎo)通路的必要因子，發(fā)生某些應(yīng)激情況時，二者根據(jù)應(yīng)激類型、時間及大腦部位的不同而發(fā)生不同改變，這種改變可引起神經(jīng)元的凋亡以及參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而二者結(jié)合強度的增高又可以發(fā)揮神經(jīng)元的修復(fù)及再生作用[22]。

BDNF參與突觸的可塑性。神經(jīng)元的生理活動過程中，BDNF廣泛轉(zhuǎn)錄合成并運輸儲存至樹突中，增加了樹突的分支，擴大了樹突面積并使樹突間產(chǎn)生各種聯(lián)系，最終增加樹突形態(tài)的多效性，影響突觸的可塑性。BDNF與TrkB結(jié)合促進神經(jīng)元胞體和樹突中BDNF合成后運送至突觸前膜，并影響突觸后膜上相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的數(shù)量及分布[23]。腦卒中恢復(fù)過程中，BDNF能夠維持損傷后的神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)形態(tài)的正常[24]，而對于新生且未成熟的神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF可以通過突觸前后的作用機制調(diào)節(jié)突觸數(shù)量、突觸功能以及樹突形態(tài)，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性[25](見圖3)。

圖3 BDNF參與腦可塑性比較

課題組在前期研究中論證了SCA的神經(jīng)功能損傷與γ-氨基丁酸(GABA)在大腦中的表達(dá)有關(guān)[26]，作為大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其減少可以引起肌張力增強，發(fā)生腦卒中肢體痙攣狀態(tài)[27]。而各類神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量及分布在突觸后膜受BDNF影響，當(dāng)BDNF表達(dá)異常時，突觸遞質(zhì)發(fā)生變化，從而引起各類神經(jīng)元功能的紊亂[28]。腦卒中肢體痙攣狀態(tài)下BDNF數(shù)量減少，隨之與TrkB的結(jié)合減少，使得突觸可塑性受到一定影響，最終導(dǎo)致GABA的釋放減少，突觸抑制性降低，神經(jīng)的興奮性增強而引起肢體痙攣，所以BDNF的表達(dá)與SCA密切相關(guān)。

本實驗通行為學(xué)觀察、電鏡觀察、Western Blot、RT-PCR方法，對腦卒中肢體痙攣大鼠海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)以及BDNF、TrkB的mRNA與蛋白表達(dá)進行觀察。結(jié)果顯示，各種治療均可改善腦卒中肢體痙攣的神經(jīng)突觸受損情況，而大腦海馬區(qū)是神經(jīng)損傷最嚴(yán)重的區(qū)域之一，海馬區(qū)中神經(jīng)突觸的重塑是恢復(fù)神經(jīng)功能的關(guān)鍵因素，針?biāo)幗Y(jié)合的方法可以更好地促進海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生，使得損傷的神經(jīng)元恢復(fù)再生，進而改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的運動功能，緩解腦卒中痙攣狀態(tài)。

針?biāo)幗Y(jié)合是在中醫(yī)學(xué)和/或現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，根據(jù)針灸、藥物作用特點和各自特長，針對同一病證形成實施針灸與藥物同時進行治療疾病的臨床方案的科學(xué)過程[29]。此過程不是二者作用的簡單疊加,而是相互補充、相互協(xié)同的關(guān)系。既往研究報道，中醫(yī)復(fù)方[30]、單味中藥[31]以及針灸[32-33]均能改善SCA損傷的神經(jīng)功能。本實驗結(jié)果證實，針?biāo)幗Y(jié)合療效優(yōu)于單純針灸或單純中藥治療，治療機制與其調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子與突觸可塑性有關(guān)。本實驗還存在一些不足，如針?biāo)幗Y(jié)合的時間、量效問題及臨床運用規(guī)律等，課題組下一步將圍繞這些問題進行研究。