IL-6 介導JAK/STAT 信號通路在膠原誘導性關節炎大鼠抑郁發生中的作用機制研究①

楊曉珊 王瑞瑞 李 英 曾祥周 （濱州市人民醫院風濕免疫科，濱州256610）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關節進行性骨破壞、侵襲性滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。由于RA 病程較長、病情遷延、致殘率高，患者易發生焦慮、抑郁等心理疾病，不僅嚴重降低生活質量，還會導致治療中斷，預后不良［1］。目前臨床對RA 伴抑郁相關問題的研究逐漸深入，但其發病機制尚未被完全闡明。Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉導及轉錄激活子（Janus protein ty?rosine kinase/signal transducer and activator of tran?scription，JAK/STAT）信號通路是重要的細胞因子信號轉導途徑之一，廣泛參與多種疾病病理、生理過程的調節，尤其在調控機體炎癥反應中起重要作用，多種細胞因子如IL-6 均是通過該通路發揮生物學效應［2-3］。此外，既往報道顯示，RA 伴抑郁患者情緒低落、記憶力及學習能力降低可能與海馬結構損傷、突觸可塑性改變密切相關［4］。另有研究指出，RA、抑郁患者滑膜及海馬組織中均存在大量炎癥細胞浸潤，通過釋放炎癥因子參與疾病進程［5-6］。為此，本研究通過建立膠原誘導性關節炎（collagen in?duced arthritis，CIA）伴抑郁的大鼠模型，探究IL-6介導JAK/STAT 信號通路在該病進展中的作用及對突觸可塑性的影響，有利于揭示RA 伴抑郁發病機制，尋找該病新的治療靶點。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 56 只 SPF 級 SD 大鼠，雌雄各半，6 周齡，體重（180±30）g，購自上海中醫藥大學［許可證號：SYXK（滬）2014-0008］。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）（北京博蕾德生物科技有限公司），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司），抗IL-6R 單克隆抗體溶液（麗珠醫藥集團股份有限公司），抗體稀釋液（北京諾博萊德科技有限公司），ELISA 試劑盒（上海邦景實業有限公司），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），BCA 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），兔抗鼠 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 單抗（美國Abcam 公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（北京中山金橋生物技術有限公司）。

EG1150 分體式包埋機、RM2265 病理切片機、DM1000 圖像分析軟件（德國Leica Microsystems 貿易公司），H7500 電子顯微鏡（日本株式會社日立制作所），DYC-ZY2 轉印電泳儀（北京東方瑞利科技有限公司），iBright Imager 凝膠成像分析系統（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 參照文獻［7］建立CIA 模型大鼠：10 mg 牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 的冰醋酸中，將此溶液4℃放置過夜后與等體積CFA 均勻混合，配置成牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/ml 的混合溶液。采用注射器反復抽吸至混合溶液充分乳化。大鼠采用0.3 ml/100 g 劑量的水合氯醛麻醉后，取該混合溶液注射于大鼠左足底皮下，0.1 ml/只，壓迫注射位置使混合溶液完全吸收。健康組以生理鹽水代替上述混合溶液，其他操作相同。2 周后左足部、踝關節發紅、腫脹，逐漸加重，并蔓延到右后足或前足，提示建模成功。

在CIA建模成功的基礎上采用慢性不可預知法建立CIA伴抑郁模型［8］，用禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、束縛 3 h、4℃ 冰水游泳、45℃ 環境 5 min、160次/min 水平振蕩30 min 7種方式刺激，第1天從7 種刺激方式中隨機選取1 種，第2 天從剩余6 種方式中隨機選取1 種，直至第7 天以此類推，7 種刺激方式每周各進行1 次，連續3 周。大鼠出現主動性活動減少、興趣缺失、食欲不振為建模成功。

1.2.2 分組及干預方法 取56 只SD 大鼠，適應性喂養7 d 后隨機選取10 只設為健康組，其余46 只建立CIA 伴抑郁模型。從CIA 建模成功的37 只大鼠中隨機抽取10只設為CIA模型組，其余27只大鼠建立CIA 伴抑郁模型，將CIA 伴抑郁建模成功的22 只大鼠隨機分為CIA 伴抑郁模型組、干預組，各11 只。干預組采用抗白介素-6 受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）單克隆抗體溶液腹腔注射，劑量40 mg/kg，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組腹腔注射等量抗體稀釋液。干預組、健康組、CIA 伴抑郁模型組自CIA 伴抑郁模型建模成功后1 d 開始干預，CIA 模型組自CIA模型建模成功后1 d開始干預。將健康組、模型組、干預組大鼠分籠飼喂，自由采食、飲水。

1.2.3 血清IL-6 水平測定 經抗IL-6R 單克隆抗體溶液干預后12 h，按0.3 ml/100 g 腹腔注射水合氯醛麻醉后，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組、干預組大鼠腹主動脈取血6 ml。取5 ml 血液2 000/rmin離心15 min（離心半徑12 cm），取上清裝管，保存于-80℃環境中。采用ELISA 法測定血清IL-6水平，嚴格按照說明書要求操作，并測定450 nm位置吸光光度值，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.2.4 組織取材 取血后立即斷頭處死大鼠，去除顱骨，充分暴露腦組織，掀起兩側頂葉，將海馬組織分離并取出。以上操作均在冰盤中進行，并于3 min 內完成。各組取5 只海馬組織放置于40%中性甲醛溶液中備用，另取5 只海馬組織放置于-80℃保存備用。

1.2.5 海馬組織病理變化、突觸界面結構觀察取40%中性甲醛溶液固定的海馬組織，流水沖洗30 min，常規乙醇脫水、石蠟包埋，以病理切片機制作成厚度為5 μm連續切片，HE染色，采用顯微鏡觀察海馬組織病理變化，并采用電子顯微鏡隨機攝片（放大20 000 倍），經圖像分析軟件參考CLIFTON等［9］方法測量海馬神經元突觸活性區長度、突觸后致密物厚度（postsynaptic dlensity，PSD）。測量示意圖見圖1。

圖1 突觸活性區長度、PSD測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of measuring length of synaptic active area and PSD

1.2.6 海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量測定 取保存于-80℃環境中的海馬組織，剪碎后加入預冷生理鹽水進行勻漿，與0.5 ml RIPA 細胞裂解液混合后進行冰上裂解，10 000/rmin離心15 min（離心半徑為8 cm）取上清，經BCA 試劑盒進行蛋白定量。取30 μg樣品與等體積上樣緩沖液混勻，配制10%分離膠行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳凝膠進行轉膜，轉膜后加入封閉液，室溫下搖床孵育2 h，加入稀釋一抗（1∶1 000），4℃ 孵育過夜，TBST 漂洗3 次，加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（1∶10 000），常溫孵育2 h，TBST 漂洗3 次。暗室中顯影，采用凝膠成像系統掃描，分析灰度值，以 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白灰度值/內參β-actin 灰度值表示蛋白相對表達量。計算p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。

1.3 統計學方法 采用SPSS25.0統計學軟件分析數據，計量資料以表示，多樣本計量資料以方差分析檢驗，兩兩樣本以LSD-t分析檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 健康組毛發柔順、光亮，活力旺盛，進食、進水及關節活動正常，CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組左足部發紅、腫脹，逐漸加重，且蔓延至右后足或前足，關節難以負重，少數發生潰瘍、紅斑，CIA 伴抑郁模型組除具有CIA 模型組表現外，另表現為呆滯少動、食欲不振、體重減輕，干預組經過干預上述表現有所改善。

2.2 各組血清IL-6 水平比較 健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組、干預組血清IL-6 水平分別為（32.82±9.16）pg/ml、（85.23±11.30）pg/ml、（102.62±21.54）pg/ml、（57.43±8.91）pg/ml，組間比較，差異有統計學意義（F=51.071，P<0.001）；CIA 模型組血清 IL-6 水平高于健康組（t=11.394，P<0.001），CIA伴抑郁模型組高于CIA模型組、健康組（t=2.280，P=0.034；t=9.480，P<0.001）；干預組低于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組（t=6.292、6.430，P<0.001），高于健康組（t=6.238，P<0.001）。

2.3 各組海馬組織病理變化情況 通過觀察HE染色結果，健康組神經元細胞為橢圓形，胞體飽滿、胞質豐富，細胞核圓且大，邊緣清晰；CIA 模型組細胞層次減少，結構模糊，細胞帶變稀、紊亂、中斷，部分神經元細胞發生核固縮、核深染變化，部分細胞核變小或消失；與CIA 模型組比較，CIA 伴抑郁模型組神經元細胞病變更為明顯；干預組細胞發生一定程度萎縮，排列較為規則，神經元細胞膜較為完整，少部分細胞萎縮、核固縮。見圖2。

圖2 各組海馬組織病理變化情況（HE染色，×400）Fig.2 Pathological changes of hippocampus in each group（HE staining，×400）

2.4 各組海馬突觸界面結構變化 電鏡觀察顯示，健康組突觸結構清晰、完整，數量多，囊泡均勻且豐富；CIA 模型組突觸結構部分溶解，界限較為清晰，突觸囊泡多；CIA 伴抑郁模型組突觸結構溶解、界限模糊，突觸前膜、后膜均不明顯，突觸小泡破裂或融合；干預組突觸數量較CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組增加，結構較為清晰，突觸間隙縮小，囊泡多。見圖3。

圖3 各組海馬突觸超微結構變化（×20 000）Fig.3 Changes in ultrastructure of hippocampal synapses in each group（×20 000）

2.5 各組海馬突觸可塑性比較 海馬突觸PSD、活性區長度組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）；CIA 模型組PSD、活性區長度均小于健康組，CIA 伴抑郁模型組小于CIA 模型組、健康組，干預組大于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組，小于健康組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組海馬CAI區突觸可塑性比較（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

表1 各組海馬CAI區突觸可塑性比較（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

Active zone length 335.95±52.67 249.75±35.511）201.63±42.851）2）283.36±35.491）2）3）8.967 0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P PSD 71.25±9.46 51.67±6.891）40.38±5.121）2）62.87±7.031）2）3）16.975<0.001

2.6 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較 海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比較，差異有統計學意義（P<0.05）；CIA模型組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均高于健康組，CIA伴抑郁模型組高于CIA模型組、健康組，干預組低于CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組，高于健康組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖4。

表2 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量比較（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo?campus in each group（）

表2 各組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量比較（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo?campus in each group（）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

p-STAT3/ STAT3 0.21±0.05 0.50±0.071）0.85±0.081）2）0.35±0.051）2）3）92.873<0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P p-JAK2/ JAK2 0.24±0.04 0.52±0.061）0.79±0.081）2）0.39±0.041）2）3）82.475<0.001

圖4 海馬組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡圖Fig.4 Immunoblot map of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein in hippocampus

3 討論

RA 是一種慢性致殘性自身免疫系統疾病，主要表現為進行性、對稱性多關節炎，最終導致關節畸變、功能喪失，嚴重影響患者身心健康，甚至引發抑郁癥等心理疾患［10］。目前臨床在治療RA 伴抑郁時以藥物治療、心理治療及聯合治療為主，可在一定程度上減輕患者癥狀，但用藥周期長，患者常因依從性不足而中斷或放棄治療，整體療效不佳［11］。近年來，隨著針對信號轉導通路、免疫細胞、促炎因子等分子靶向治療方式的出現，RA 伴抑郁的治療已邁向靶向治療時代。RA 伴抑郁病變組織以自分泌、旁分泌方式釋放大量細胞因子，從而介導蛋白質水解、細胞增殖、炎癥免疫，參與滑膜及海馬組織病變過程。由于絕大部分細胞因子為糖蛋白或多肽，須結合靶細胞表面對應受體，激活相應的信號通路方可具有生物學效應，因此，RA 伴抑郁中細胞因子介導的信號轉導通路已成為研究熱點。

本研究顯示，HE 染色結果中干預組細胞發生一定程度萎縮，與CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組比較，細胞變化不明顯，提示下調IL-6 可改善RA 伴抑郁大鼠海馬組織病理變化；電鏡觀察干預組突觸數量較CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組增加，結構較為清晰，突觸間隙縮小，囊泡多，提示下調IL-6 可改善海馬突觸界面結構變化；健康組、干預組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組的PSD、活性區長度依次減小，提示下調IL-6 可減輕突觸可塑性損傷。突觸是連接神經元、傳遞神經信息的關鍵部位，也是神經可塑性變化的敏感結構。突觸可塑性變化是突觸形態、功能的改變，目前通常以PSD、活性區長度、間隙寬度及界面曲率等突觸界面結構參數作為反映突觸可塑性變化的敏感指標［12-13］。IL-6 是由活化T 細胞、單核/巨噬細胞分泌的糖蛋白，可結合可溶性IL-6R 誘導分泌血管內皮生長因子，促使內皮細胞增殖、遷移，導致血管翳形成，在RA 骨與軟骨破壞、關節滑膜炎中具有重要作用［14］。IL-6在RA機體中處于高表達狀態，可進一步促使腦部膠質細胞、神經元釋放激素及神經化學物質，并激發促腎上腺皮質激素釋放激素對下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸的調節作用參與抑郁癥發生、發展。LI 等［15］研究認為，RA 患者的血清IL-6 水平顯著高于健康受試者，RA伴抑郁患者則更高，且血清IL-6水平與抑郁程度呈正相關。本研究通過對CIA伴抑郁模型大鼠注射抗IL-6R 單克隆抗體溶液，海馬組織病理變化及突觸界面結構變化減輕，PSD、活性區長度增大，表明下調IL-6 可減輕海馬組織及突觸界面結構變化、突觸可塑性損傷。

此外，本研究中，健康組、CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組海馬組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3依次升高，提示在RA、RA 伴抑郁發病過程中JAK/STAT 信號通路處于激活狀態，經IL-6R 抗體干預后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 較 CIA 模型組、CIA 伴抑郁模型組降低，但仍低于健康組，說明下調IL-6 后可能進一步抑制JAK/STAT 信號通路，發揮減輕RA伴抑郁突觸損傷作用。JAK2屬于非跨膜型酪氨酸激酶JAK 家族成員，可介導細胞增殖、免疫功能、造血等多種細胞因子生物學活性，通過結合跨膜細胞因子受體，誘導受體二聚化，啟動JAK2 激酶磷酸化，隨后招募STAT3，催化STAT3 發生磷酸化［16-17］。活化的STAT3蛋白進入細胞核中結合DNA靶序列，對相應基因表達進行調節，介導細胞因子自胞外向胞內傳遞的過程。IL-6 與IL-6R 復合物結合于公共轉導子gp130 后，可促使與IL-6 偶聯的JAK2 激酶互相聚集并磷酸化，從而發揮生物學功能。TIAN 等［18］通過基因沉默技術使 JAK/STAT 信號通路失活，結果顯示抑郁模型大鼠腦源性神經營養因子表達上調，從而抑制海馬神經元凋亡，減輕抑郁癥狀，綜合兩項研究提示可通過阻斷JAK/STAT 信號通路減輕抑郁病情。本研究表明IL-6 通過激活JAK/STAT 信號通路，參與調控RF 伴抑郁炎癥反應發生、發展，推測針對性阻斷JAK/STAT 信號通路可達到減輕抑郁病情的目的。

綜上所述，IL-6 介導JAK/STAT 信號通路參與RA 伴抑郁進展過程，推測下調IL-6 阻斷JAK/STAT信號通路可改善海馬組織病理變化及海馬突觸界面結構變化，減輕突觸可塑性損傷。以IL-6 介導JAK/STAT 信號通路為靶目標可能為RA 伴抑郁的治療提供新思路。