單克隆抗體藥物穩定性影響因素及優化策略①

王傳杰 馮健男 王 晶

（軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850）

在過去的30年里，單克隆抗體（monoclonal anti?body，mAb）的研發和優化技術已經取得了長足的發展，現階段治療性單克隆抗體藥物已經廣泛應用于自身免疫病、腫瘤以及病毒感染等疾病的臨床治療或預防，且已成為生物制品類藥物中發展最快的一類。學者們在長期研究中除了重點關注抗體結構的優化，還針對抗體穩定性的各種影響因素提供了諸多解決方案，以此降低抗體藥物的開發、儲存成本，并提高其臨床療效［1-3］。本文簡要回顧了近些年單克隆抗體穩定性的影響因素和理化機制以及抗體穩定性改造方案等方面的研究進展。

1 抗體分子結構及穩定性研究意義

1.1 抗體分子結構 抗體是指由機體產生能與抗原特異性結合的免疫球蛋白。抗體由B淋巴細胞轉化而來的漿細胞分泌產生，每個B 淋巴細胞株只能產生一種它專有的、針對一種特異性抗原決定簇的抗體。這種從一株單一細胞系產生的抗體就叫單克隆抗體（mAb），簡稱單抗。常規的單抗分子是由兩條重鏈（HC）及兩條輕鏈（LC）通過鏈間二硫鍵連接成“Y”形結構（圖1），它又可分為3 個功能組分：兩個抗原結合片段（Fab）和一個結晶區（Fc），兩個Fab 通過鉸鏈區連接到Fc，且構象變化相比于Fc 更為靈活。由來自重鏈和輕鏈的一對可變區（VH 和VL）組成 Fab 的 Fv 區，通常 Fv 區被糖基化修飾，是決定抗體如何與適應性免疫及體液免疫系統中的其他成分相互作用的關鍵。

圖1 完整IgG 抗體帶狀圖［來源：蛋白結構數據庫（PDB）；ID：1igt］Fig.1 Complete structure of IgG［From：Protein Data Bank（PDB）；ID：1igt］

1.2 穩定性研究意義 研究發現，某些單克隆抗體藥物雖然在體外實驗中表現出良好的藥物活性，但在進入臨床試驗階段卻會遭遇到體內活性降低的問題［4］。因此在藥物研發的初期就要兼顧其藥效動力學的問題。抗體藥物的穩定性是影響抗體藥效動力學的關鍵因素之一，首先抗體的高親和力與高特異性都需要以穩定的結構為基礎，這是其正確行使生物學功能的保障。其次，抗體的穩定性越高，則其新生肽鏈在細胞內裝配時產生錯誤折疊（mis-folding）的概率越低，可溶性表達量也越高［5］。良好的熱穩定性所帶來的緊湊結構使抗體的蛋白酶切位點更不易暴露，并其影響藥品保質期及存放條件，關系到藥物成本。目前，提高蛋白質熱穩定性的方法主要有非共價修飾、化學修飾、添加蛋白質穩定劑、蛋白質工程，以及在液體狀態利用礦化技術直接在蛋白表面形成磷酸鈣礦化外殼以提高蛋白質的穩定性［6］。

由此可見，在保證抗體親和力及表達量等性質不受太大影響的情況下，最大程度上提高其穩定性，對抗體藥物的研發具有重要的現實意義。

2 影響抗體穩定性的因素

2.1 抗體分子自身性質 抗體分子一級結構（蛋白序列）對其聚集性有著重要影響，例如當抗體分子的等電點（pI）過高或過低時決定簇互補區（com?plementarity-determining region，CDR）都會促進聚集，不同的是較低pI 的分子所產生的分子間靜電相互作用形成了可溶的聚集物，而較高pI 的分子，尤其是當和帶有負電荷的容器表面接觸時，則會形成沉淀性聚集［7］。例如有研究比較了英夫利昔單抗（infliximab）及其仿制藥在強制性降解試驗（forced degradation）中的表現［8］，發現二者盡管在生產工藝和制造過程上有些許不同，但在該試驗中并未表現出明顯差異，說明一級結構仍然在很大程度上決定了抗體分子的穩定性。還有研究比較了IgG 分子的3 個亞型（IgG1、IgG2、IgG4）在分別經過酸性處理（pH=3.3）之后的表現，結果IgG1 保持了單體形式，而另外兩個亞型均表現出二聚化傾向，且當恢復到正常pH時導致IgG4形成聚集體［9］。該結果與pH在4～7 范圍內 IgG 亞型聚集性（IgG1

2.2 環境應力因素 溫度：高溫能夠破壞單抗結構，且通常不可逆，進而導致聚集；同時伴隨溫度增高，脫酰胺和氧化反應發生的概率也增加［12］。當環境溫度下有50%左右的蛋白天然結構展開時，將該溫度定義為熔解溫度（melting temperature，Tm），每種蛋白都有其Tm，一般該溫度范圍為40℃～80℃之間，而通常生物藥品儲存運輸的溫度在2℃～8℃之間，遠低于該溫度［13］。此外過低溫也會引起蛋白變性，尤其是在反復凍融的情況下。隨著凍融次數增加，會出現緩沖液pH 值下降、溶質分子濃縮、水冰界面形成等因素的影響［14］。當0.5 mg/ml 貝伐珠單抗（bevacizumab）溶液經受1～30次凍融循環時，其單體峰通過（size exclusion chromatography，SEC）分析，發現隨著循環次數的增加而降低。在類似的研究中，對于固定數量的循環凍融（10 個循環），單體峰值隨著貝伐珠單抗濃度的增加而降低，這表明在較高濃度下凍融循環的穩定性有所提高［15］。

光照：蛋白質的芳香族殘基（以色氨酸殘基為主）對光照非常敏感，易發生光氧化形成氧化自由基，隨后發生斷裂和交聯，尤其是紫外光相較于白光影響更大［16］。有研究證實光照對蛋白質二級和三級結構的影響取決于其存在形式，通常凍干粉比液體制劑更能耐受光照。LUIS 等［17］通過采用ICH Q1B（International Council for Harmonisation，ICH Q1B conditions）推薦值（132 萬勒克斯小時）和環境光照強度（24 萬勒克斯小時）評估了兩種單克隆抗體的光穩定性，結果顯示出巨大的差異，表明單抗藥物的光穩定性取決于總的曝光量而不是光強度。SHAH 等［18］發現了在 ICH 光照條件下雖然總體上未觀察到明顯的抗體結構變化，但CH2 結構域仍然存在降解。蛋白質藥物主要的光暴露發生在儲存運輸和給靜脈輸液患者用藥期間，因此在藥品應用階段規避這一因素的影響就顯得尤為重要。

機械應力：在單抗藥物生產使用過程中還會受到機械應力（如攪拌或剪切力）的影響。研究證實由于疏水性基團（主要是巰基）暴露，在該過程中形成了大量規格在1.5～80 μm 不等的聚集體，且聚集水平與氣-液界面積呈指數關系［19］。藥物制劑在通過輸液管或注射器時會產生剪切力作用，已有研究報道了高濃度單抗溶液的剪切稀化現象（剪切力下黏度的降低），這可能與自身聚集的單抗分子解離有關，但目前尚不清楚過濾過程中的剪切力是否會引起其他改變［20］。

2.3 存儲方式因素 濃度：高濃度下的單抗制劑由于黏度增加，分子間相互作用增強也會促進聚集［21］。HAUPTMANN 等［22］發現高濃度僅僅會增加制劑中小顆粒的數量，而分子量大的聚集物反而減少了；NICOUD 等［23］則觀察到聚集物隨濃度增加而增加的現象。有研究指出，雖然降低抗體濃度可以使結合性較弱的聚集體解離，但若不同時改變抗體分子與輔料的比例，則會稀釋藥物制劑中的輔料（具有保護性的糖類、表面活性劑或精氨酸），影響了溶液本身的pH 值和離子強度，導致抗體分子化學穩定性降低［24］。此外，蛋白質分子自身具備聚合傾向，是由分子間的電荷相互作用所主導，且受溶液的離子強度影響［25］。

包裝：除對單抗藥物固有屬性及結構的優化外，也不能忽略在現有生產條件下包裝存儲方式的影響。蛋白質作為表面活性分子，有吸附到疏水界面的傾向從而導致產品損失、效力降低和潛在的劑量不足［26］。KUMRU 等［27］的研究結果表明聚氯乙烯（PVC）材質的輸液袋（Ⅳ-bags）相較于聚烯烴材質對1 mg/ml 的IgG4 溶液吸附效果更明顯，且顆粒物和渾濁度明顯增加，而在加入聚山梨酯20后兩種輸液袋中的顆粒數降低至接近陰性對照。

3 影響抗體不穩定性的機制

造成抗體不穩定性的因素大致劃分為化學不穩定性因素和物理不穩定性因素。它們各自對抗體性質產生影響，且彼此相互作用：相關化學反應可導致物理不穩定性［13］，物理不穩定性又可使某些活躍的化學基團產生變化，或將有可能相互作用的基團間距離拉近［28］。

3.1 化學不穩定性的作用機制 氧化作用：化學降解不僅不利于抗體藥物的儲存，在應用中還會使藥物有效性發生損耗。氧化反應（包括二硫鍵的形成）是最常見的引起化學降解的因素，這種氧化可以發生于氧化劑（例如：光照、過氧化物或者活潑金屬）存在的情況下，也可以自發氧化的形式產生［29］。 抗體分子中相當一部分氨基酸基團易被氧化，例如甲硫氨酸、組氨酸和半胱氨酸［29-30］。二硫鍵的形成即發生在兩個半胱氨酸的巰基之間，且類似的氧化不僅可發生在單個分子內部，也可在分子間產生。

脫酰胺作用：另一個引起降解的因素便是脫酰胺化，涉及含天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）殘基的位點。脫酰胺化類似于酸堿反應，是在臨近反應位點的質子供體（通常為絲氨酸或者蘇氨酸）參與下形成環酰亞胺中間物，從而破壞抗體本身的結構［31］。例如Asn 經脫酰胺化往往生成琥珀酰亞胺，之后很快自發水解為天冬氨酸或異天冬氨酸（Asp）。

水解作用：在抗體分子中另一大化學性質不穩定因素便是二硫鍵或肽鍵的斷裂［29］。其中在單抗藥物正常使用過程中“單價抗體”的形成就是由二硫鍵斷裂導致［29］。而肽鍵斷裂則形成大量性質和大小不一的小分子量片段，且尚不能確定該現象是由酶解導致。同樣的，抗體分子中鉸鏈區的水解機制亦不明確，例如在研究木瓜蛋白酶對單抗裂解的過程中加入蛋白酶抑制劑并不能改變抗體分子的斷裂，因此推測可能是由某種非酶解機制導致的該現象。盡管具體機制尚不明確，但抗體分子這一降解途徑通常發生在強酸或者高溫環境中［30］。

輔料作用：除了上述可能由環境影響發生的降解外，糖類作為常用的輔料亦會對抗體分子產生影響。研究發現蛋白質在還原糖作用下可發生糖基化（glycosylation），最終形成酮胺而導致褐變，且從抗體在胞內克隆直至靜脈注射，該反應都有可能發生［31-32］。雖然現在大多廠商以非還原糖作為輔料，但其依然可以降解為還原糖從而影響單抗藥物結構和功能［32］。

化學修飾對于單抗藥物性質的影響程度取決于其修飾位點［33］。例如，脫酰胺化在Fc段發生所造成的影響很小，但若發生在CDR 上則會降低單抗的親和力及效價；同樣的，氧化反應若是發生在Fc 段則不僅會降低結合親和力，更會增加單抗在人體內的清除率從而降低血藥濃度［34］。一些研究表明，化學不穩定性還會導致蛋白構象的改變和分子聚集，例如甲硫氨酸氧化易引起二級結構穩定性改變。

3.2 物理不穩定性相關機制 蛋白質變性往往意味著高級結構的展開，上述化學不穩定性改變、環境因素（溫度及pH）等都有可能導致這一結果，并隨之降低抗體鉸鏈區的活動性，增加聚集性［29］。聚集性增加是最主要的物理不穩定性改變，聚集體由多個蛋白質分子通過非共價鍵（范德華力、氫鍵、疏水和靜電相互作用）相鏈接，而不涉及一級結構和蛋白序列的變化。此外還有部分聚集體是通過二硫鍵等共價鍵相締合，稱為共價聚集［13］。這兩種聚集最終都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物。

抗體的聚集大多都是不可逆的，尤其是在后期當形成的聚集物是由大量非天然結構的抗體分子組成的時候［35］。有學者提出了抗體聚集物有可能通過兩種途徑使正在接受單抗類藥物治療的患者產生免疫原性：T 細胞依賴途徑以及細胞因子激活途徑。而且分子量越大的聚集物其免疫原性越強，且糖基化程度、聚集產物來源等亦對其有影響［2，36-37］。最終，免疫原性反應不僅大幅降低了藥物的體內療效，而且易引發Ⅰ型超敏反應。當然，上述現象僅在體外實驗及動物模型中觀察到，并預測了聚集物在人體內的風險效應，其具體的機制仍然有待探究［38］。

4 抗體穩定性評估方法

生物技術產品穩定性評估通常包括生物活性分析、分子結構和純度分析（含降解產物的定量檢測）以及相關參數的監測（如外觀、pH值等），綜合以上數據來對樣品的熱穩定性、聚集性和分子間作用力大小做出評估。在對抗體效價和穩定性進行評估的方法中，除了最常用的間接ELISA法外，還常應用差示掃描量熱儀（DSC）測量蛋白質熱穩定性，其不僅可以得到熔化溫度，還可以得到與熔化有關的焓、熵和自由能［39］。進一步發展而來的差示掃描熒光法（DSF）、圓二色（CD）光譜法、動態光散射（DLS）檢測技術都朝著高通量、高精度或者對蛋白質水動力學監測等方向改進［40］。此外在蛋白質溶解性預測方面，研究者們相繼提出了交叉作用色譜法（CIC）、親和捕獲自身相互作用-納米粒子光譜法（AC-SINS）或克隆自身相互作用-生物層干涉法（CSI-BLI）等技術，取得了一定的進展，這些方法評估單克隆抗體在低蛋白濃度下的交叉或自身相互作用的可能性，從而預測單克隆抗體在高濃度下的特性。隨著計算機輔助設計在生物大分子開發中的應用，對不確定晶體結構的分子，可以利用大量的建模和仿真軟件來預測抗體-抗原復合物的三維結構；也可使用不同的力場進行分子動力學（molec?ular dynamics，MD）模擬［41］，獲得更多有關結合相互作用、穩定性的詳細信息，并使非共價鍵能（疏水能、靜電能、非極性能和結合能）的計算變得更容易。

5 穩定性改造方案

5.1 抗體分子結構改造 基于抗體分子易受化學修飾位點進行結構改造，一直以來是其穩定性優化的重要方向。其中抗體CDR 區的去酰胺作用可能導致對抗原結合功能喪失，已有研究逐步闡明去酰胺化和化學修飾的機制以及它們的影響。且有研究證實Gln 的脫酰胺速率比Asn 慢得多，因此，通過將Asn 突變為Gln 來移除脫酰胺位點或者降低脫酰胺效應的發生概率被視為一種解決方案［42］。研究還發現在一級序列中緊跟在Asn后面的氨基酸類型被認為是脫酰胺傾向的重要決定因素，若采用側鏈較大的氨基酸（通常為纈氨酸和異亮氨酸）替代能夠使得Asn對脫酰胺作用的抵抗力更強［42］。本課題組前期工作中利用計算機分子模建系統發現HER2抗體赫賽汀（Herceptin）LC-Asn30 和 HC-Asp102 兩個脫酰胺和異構化的降解熱點，經同性突變為LCGln30和HC-Glu102后，抗體穩定性得到明顯提高且原有生物學活性沒有發生改變［43］。

此外，抗體特定位點的糖基化修飾，決定其不同效應配體的功能，同時糖基化可以增強單克隆抗體藥物的穩定性和溶解性，并能降低單克隆抗體藥物的聚集趨勢［44］。HIGEL 等［44］使用多變量數據分析評估了單克隆抗體糖基化與培養液中氨基酸種類及數量的關系，為今后在細胞培養過程中進行控制糖型的研究提供了新思路。THARMALINGAM等［45］通過一種新型的實時糖基化監測儀器（微量順序注射系統與超高效液相色譜相結合）研究Mn2＋濃度對抗體糖基化的影響，實現了通過調節培養基中Mn2＋濃度來控制產物糖型結構，為糖基化研究提供了新方法。SHA 等［46］基于生產工藝的改進，通過代謝分析和數學模型相結合的方法進一步控制了重組蛋白的糖基化程度，實現了對產物效應功能的優化。

5.2 生產工藝優化 有研究指出，過酸或過堿條件下抗體都會發生不同途徑的降解［47］。在pH6.8靜脈注射用免疫球蛋白（IGIV）制劑中，這種由pH導致的不穩定性通過加入麥芽糖穩定劑可以得到改善；而在以CHO 細胞系為表達系統的體系中，HOGIRI 等［48］建立以活細胞數、凋亡細胞數、死細胞數、產物量（mAb），培養體積和pH 值等 6 大參數為主體的pH 依賴性動力學模型，用數值優化方法來估計整個細胞培養時間內的pH 值變化規律，進而在生產階段制定出有效的pH優化策略。

表面活性劑通常被添加到單抗藥物配方中，以減少疏水區的暴露，或者通過競爭吸附位點從而減少蛋白質相互作用和界面誘導的聚集，其中常用的非離子表面活性劑有聚山梨酯20和聚山梨酯80［49］。此外，某些氨基酸也常被作為賦形劑用以保護聚集，常用的精氨酸（Arg）能夠增加蛋白質的溶解度，并能保護其免受光照和高溫誘導的聚集。TOTH等［50］證實了（Arg）氫氯化物能夠提升熱穩定性，同時減少攪拌誘導的聚集。脯氨酸（Pro）作為一種環狀氨基酸，被認為通過與芳香殘基和暴露的疏水區結合而增強mAb 的溶解，從而降低蛋白質-蛋白質的相互作用和溶液黏度，減少其pH 值在pI 附近時的聚集［51］。

而通過對抗體藥物成品在儲存或包裝方式上的改進往往更具經濟性。SREEDHARA 等［52］研究表明，去除輸液袋的頂部空隙可以減少攪拌誘導的聚集體形成；此外容器對藥物溶液中的輔料（緩沖液、表面活性劑、防腐劑、其他穩定劑等）的吸附也會導致它們濃度的降低從而不再滿足單抗藥物穩定性的要求。迄今為止防止蛋白質與容器表面相互作用的方法是對表面進行涂層，即表面鈍化。涂層大致可分為兩類：單層涂層（較常用）和多層涂層（不太可控），較常用的涂層聚合物包括乙二醇或環氧乙烷［53］。此外，若使用帶極性或中性電荷的聚合物涂層也能夠減少蛋白質的吸附［54］

6 結語

治療性單克隆抗體藥物是當下生物醫藥領域的研發熱點，且以此為基礎開發出的單鏈抗體（scFv）、單域抗體、抗體-藥物偶聯物（ADC）等應用于各器官系統疾病的藥物也相繼獲批上市。如何在不改變藥物靶向性、兼顧療效和免疫原性的同時提高藥物自身穩定性，盡可能延長藥物半衰期，保持有效的血藥濃度是當下亟待解決的問題。抗體穩定性受到環境、配方、自身結構及生產操作等多種因素影響，而對抗體穩定性的有效評估是進行個體化改造的前提。穩定性評估不應僅僅根據有無降解產物或穩定性分子的濃度來定義，而應該包含以下3 方面：物理穩定性研究的評估應該涵蓋聚集體和碎片數目以及單抗結構；化學穩定性研究應關注蛋白降解情況；生物穩定性研究應保證單克隆抗體對靶點的活性與其物理化學穩定性保持一致。深入探討抗體穩定性影響因素及評估方法，有助于抗體藥物的合理優化以及新藥的研發。