山楂原花青素和VC聯合通過Wnt/β-catenin通路減輕胰島素抵抗大鼠肝臟氧化應激

李西棟，孫紹霞，梁亞楠，石塔拉，宓 偉,*

（1.臨沂市人民醫院心血管內科，山東 臨沂 276000；2.濱州醫學院公共衛生與管理學院，山東 煙臺 264003）

胰島素抵抗是由胰島素的受體數量下降、分子結構功能異常和拮抗激素分泌過多等因素引起的胰島素靶器官對內源性或外源性胰島素的敏感性和反應性降低[1]。胰島素抵抗使機體對葡萄糖的攝取和利用率降低，長時間持續會使調節血糖水平的肝臟受損，所以肝臟氧化應激在胰島素抵抗的發展進程中起著非常重要的作用[2-4]。

山楂原花青素（hawthorn proanthocyanidin，HPC）主要來源于山楂，是低聚體形式的原花青素，研究結果顯示其抗氧化能力遠高于來源于葡萄籽和松樹皮的高聚體原花青素[5-6]。另外，大多數研究認為原花青素是改進胰島素敏感性的有效物質，但機制尚未闡明。原花青素增加胰島素敏感性機制的研究主要集中在胰島素信號傳導通路上關鍵分子的表達及活性改變方面，然而結論卻并不一致，且主要以高聚體的葡萄籽原花青素為主，而氧化活性強的HPC鮮見研究。VC在蔬菜和水果中含量十分豐富，具有很強抗氧化能力，同時還能保護其他物質免受氧化破壞[7]。Wnt/β-catenin信號通路可由Wingless/integrated protein 1（Wnt1）、Wnt2、Wnt3α和Wnt8等蛋白激活，與細胞表面Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh結合后，Dsh被激活并抑制下游軸蛋白/糖原合酶激酶-3β/腺瘤樣息肉病蛋白（Axin/glycogen synthasc kinase-3β/adenomatous polyposis coli protein，Axin/GSK-3β/APC）復合物，Axin/GSK-3β/APC復合體可抑制細胞內信號分子β-catenin的降解，使得胞漿內的β-catenin大量積聚，部分β-catenin進入細胞核與T-Cell factor/Lymphoid Enhance Factor轉錄因子家族如原癌蛋白（C-myc）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）、生存素（survivin）、Axin2和白細胞分化抗原44（cluster of differentiation 44，CD44）等作用并促進其表達，而PPARγ的表達與胰島素抵抗的發展密切相關[8-10]。HPC聯合VC之間抗氧化有無協同作用且通過Wnt/β-catenin信號通路減輕胰島素抵抗氧化應激鮮見相關報道。本實驗采用喂養大鼠高脂飼料制造胰島素抵抗模型，并探討HPC和VC聯合作用通過Wnt/β-catenin分子信號通路調控PPARγ表達對大鼠胰島素抵抗以及胰島素的敏感性和反應性的影響，為功能食品開發和研制胰島素抵抗肝臟氧化應激治療新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠90 只，7～8 周齡，體質量（189±12）g，SPF級，由濱州醫學院實驗動物中心提供（生產許可證：SCXK（魯）2017-0012）。在無特定病原體的條件下常規喂養大鼠，適應性喂養1 周后用于實驗。

One-Touch全自動血糖儀及配套血糖試紙美國強生公司；胰島素酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國Millipore公司；血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒 南京建成科技有限公司；HPC（純度95%） 中國西安綠天生物技術有限公司；VC、二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 武漢優爾生科技股份有限公司；兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗體美國Sigma公司；β-actin多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體 武漢三鷹生物公司；總RNA提取試劑盒、SYBR green試劑盒 日本Takara公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；凝交成像分析系統 美國Alpha Innotech公司；熒光實時定量聚合酶鏈式反應儀 澳大利亞Corbett公司；熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）分析儀 上海格羅貝爾生物科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 胰島素抵抗大鼠造模

將90 只雄性Wistar大鼠采用隨機數字表法分為對照組10 只和高脂膳食組80 只。對照組給予配比為玉米73.5%（質量分數，后同）、麥麩20%、魚粉5%、骨粉1%、食鹽0.5%的普通飼料，脂肪供能占61%；高脂膳食組給予配比為普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%的高脂飼料，脂肪供能占87%。兩組大鼠同時喂養6 周，分別稱量造模前后正常對照組和造模成功的高脂膳食組大鼠體質量，計算2 組大鼠在造模前后的體質量變化。造模成功后，對大鼠禁食12 h，次日上午將所有大鼠全麻，斷尾取血1 mL，采用One-Touch全自動血糖儀檢測大鼠空腹血糖濃度。同時對所有大鼠進行眼眶靜脈取血，4 ℃、20 000 r/min離心20 min取上清液，參考ELISA試劑盒檢測血清胰島素濃度，參照試劑盒說明書用比色法檢測血清ALT、AST和ALP活力。大鼠空腹血糖濃度不低于6.5 mmol/L且血清胰島素濃度不低于35 μIU/mL為造模成功。

1.3.2 大鼠肝勻漿相關指標水平檢測

將造模成功的胰島素抵抗大鼠隨機分為模型組、HPC組、VC組、HPC+VC組和二甲雙胍組，每組10 只。對各組大鼠進行5 mL等體積灌胃：正常對照組和模型組（等體積生理鹽水）、HPC（56 μg/mL）組、VC（180 μg/mL）組、HPC（56 μg/mL）+VC（180 μg/mL）組和二甲雙胍（2 μg/mL）組[11]，每日1 次，連續給藥12 周后，禁食12 h后，眼眶靜脈取血檢測葡萄糖和胰島素水平，然后將大鼠脫臼處死，解剖后迅速出取肝臟，用生理鹽水沖洗并用濾紙吸干，稱取250 mg肝臟并剪成小塊，置于玻璃勻漿管內，加入2.25 mL預冷的pH 7.4、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，制備質量分數10%的肝勻漿備用，按照各試劑盒說明書分別測定各組大鼠肝勻漿中的SOD、CAT、GPx、GSH、MDA水平。

1.3.3 實時聚合酶鏈式反應檢測Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ的mRNA表達水平

將預處理的大鼠肝細胞以0.5×106個/孔的密度接種于6 孔板。按照TRIzol法提取細胞總RNA，然后通過反轉錄試劑盒將mRNA反轉成cDNA，采用SYBR green試劑盒進行熒光定量檢測。通過ΔΔCt方法計算相對mRNA表達水平，并選擇GAPDH作為內參基因[12]，通過熔解曲線分析產物的特異性。引物序列參見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 蛋白質印跡法檢測肝組織Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的表達水平

取肝勻漿200 mg，加入少量0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽溶液清洗2 次，4 ℃、20 000 r/min離心棄去上清液，瀝干后加入1 mL裂解緩沖液，冰上靜置40 min，收集裂解液，4 ℃、20 000 r/min離心20 min，取上清液至EP管備用。取20 mg蛋白樣品，加入6%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，沸水變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝交電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后濕移至聚偏二氟乙烯膜上；用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，依次加入兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗體和相應β-actin多克隆抗體，4 ℃過夜，加入0.05 mol/L pH 7.8的Tris緩沖溶液洗膜后，滴加ECL發光試劑進行檢測，曝光20 s～5 min，顯影2 min，定影5 min，采用Quantity One軟件掃描各條帶，獲取目的蛋白灰度值，實驗重復6 次。

1.3.5 熒光共振能量轉移分析法檢測Wnt1和Dsh結合情況

采用FRET分析儀檢測Wnt家族分泌蛋白Wnt1和Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh之間是否能形成異源二聚體，分別制備對照組、模型組、HPC組、VC組、HPC+VC組和二甲雙胍組處理12 周后的大鼠肝細胞的DNA和蛋白質，采用分子克隆方法構建用于FRET的兩個真核重組質粒：pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1。質粒構建成功后，利用pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1分別轉染上述制備的6 組肝細胞，轉染后24 h，檢測FRET信號。

1.4 數據處理與分析

實驗數據用平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 胰島素抵抗大鼠造模結果

80 只大鼠給予高脂膳食喂養，有54 只造模成功，成功率67.5%。如表2所示，造模后，模型組大鼠的空腹血糖、血清胰島素、ALT、AST和ALP水平均顯著高于對照組大鼠（P＜0.01）。

表2 造模后對照組和模型組大鼠各檢測指標比較Table 2 Comparison of all tested parameters between control and model groups

2.2 大鼠肝勻漿中各指標檢測結果

如表3所示，與對照組相比，模型組大鼠SOD、CAT、GPx、GSH水平均極顯著下降（P＜0.01），而MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，HPC組、HPC+VC組和二甲雙胍組大鼠肝勻漿中各指標含量均有極顯著差異（P＜0.01）。HPC+VC組對肝勻漿中各指標干預效果優于HPC組（P＜0.05）。

表3 大鼠肝勻漿中各指標檢測結果（n＝10）Table 3 Parameters in rat liver homogenate (n = 10)

2.3 HPC和VC聯合對Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ mRNA表達的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1和β-catenin的mRNA相對表達水平極顯著增加（P＜0.01），分別增加102.34%和110.62%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低56.12%、60.34%、53.41%和70.05%。與模型組比較，HPC+VC組Wnt1和β-catenin的mRNA相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了35.61%和45.21%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相對表達水平極顯著升高（P＜0.01），分別升高了51.37%、69.54%、42.39%和61.54%。

圖1 Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ的mRNA相對表達水平（n＝6）Fig.1 mRNA expression of wnt1, Axin, GSK-3β, APC, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.4 HPC和VC聯合對肝組織Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Wnt1和β-catenin的蛋白相對表達水平極顯著升高（P＜0.01），蛋白相對表達水平分別升高了56.31%和68.15%；PPARγ的蛋白相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），蛋白相對表達水平降低了82.61%。與模型組比較，HPC+VC組Wnt1和β-catenin的蛋白相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了38.25%和47.64%；PPARγ的蛋白相對表達水平極顯著升高（P＜0.01），升高了76.28%。

圖2 Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的相對表達水平（n＝6）Fig.2 Relative protein expression levels of Wnt1, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.5 FRET檢測配體Wnt1和受體Dsh結合狀況

轉染24 h用FRET分析儀檢測，激光共聚焦顯微鏡觀察結果如圖3所示。為獲得FRET圖像，通過受體組獲得摩爾吸光系數為0.60，通過配體組獲得摩爾吸光系數為0.53，配體Wnt1表達數量多呈現黑紫色，數量少呈紅色，受體Dsh呈藍紫色，配體Wnt1和受體Dsh結合形成數量少顯示綠色，形成數量多會出現紅黃色。與模型組相比，HPC+VC組的FRET信號明顯減弱，說明隨著時間的延長，Wnt1與Dsh之間的結合力明顯減弱，形成的異源二聚體數量明顯減少。

圖3 24 h后FRET信號結果（60×）Fig.3 FRET signals acquired after 24 h (60 ×)

3 討 論

肥胖是導致胰島素抵抗的主要原因之一，亦會損害肝臟使其氧化應激能力降低，加劇2型糖尿病的發生和發展[13-15]。血清中ALT、AST和ALP升高可能與肝細胞的損傷有關[16]，本研究中，造模成功的胰島素抵抗大鼠血清ALT、AST和ALP水平均高于對照組大鼠（P＜0.01）。研究證明，發生胰島素抵抗時，肝細胞氧化應激能力增強，氧化應激與肝細胞損傷有密切聯系[17-18]。肥胖導致肝臟過氧化，過氧化產生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）增多，ROS和RNS氧化和損傷機體細胞內的基因，還可以激活細胞內Wnt/β-catenin通路，該分子信號通路與胰島素抵抗和肝細胞功能受損密切相關[19-21]。本實驗中，通過HPC和VC聯合應用干預胰島素抵抗大鼠，肝勻漿中SOD、CAT、GPx活力和GSH含量均顯著升高而MDA含量顯著下降（P＜0.01），效果優于單獨使用HPC干預，明顯降低了胰島素抵抗大鼠的肝臟氧化應激能力，改善胰島素抵抗[22-24]。

PPARγ是一類配體激活的核轉錄因子，當細胞接受Wnt信號刺激時，Wnt蛋白作為配體與細胞膜表面的Frizzled家族跨膜受體蛋白Dsh結合，Dsh通過磷酸化被激活，通過Dsh的DIX和PDZ結構域抑制GSK-3β破壞復合物Axin/GSK-3/APC活性，β-catenin能夠積聚并定位于細胞核，隨后通過基因轉導以及T細胞因子/淋巴增強因子誘導Wnt蛋白表達，如PPARγ轉錄降低，使外周組織對胰島素的敏感性和靈敏性降低，而發生胰島素抵抗[25-27]。胰島素抵抗大鼠同時攝取HPC和VC，與模型組比較，Wnt1的mRNA和蛋白相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），分別降低了35.61%和38.25%，FRET信號明顯減弱，Wnt1與Dsh之間的結合力明顯減弱，形成的異源二聚體數量明顯減少，Axin、GSK-3β、APC的mRNA相對表達水平極顯著升高（P＜0.01），β-catenin的mRNA和蛋白相對表達水平極顯著降低（P＜0.01），PPARγ的mRNA和蛋白相對表達水平極顯著升高（P＜0.01），初步說明HPC+VC聯合作用通過Wnt/β-catenin通路減輕胰島素抵抗大鼠氧化應激，且HPC和VC為食物中的植物活性成分和營養素，值得進一步提取研究和開發，從而應用于臨床預防和治療疾病[28-30]。

綜上所述，HPC和VC聯合應用改善胰島素抵抗大鼠肝臟氧化應激與Wnt/β-catenin通路調節PPARγ有關，但是二者聯合如何抑制Wnt1蛋白分泌的機制有待于進一步研究探索。