貞芪扶正顆粒輔助奧沙利鉑治療H22 移植瘤小鼠的療效及其對Bax、Bcl?2 表達的影響

周熙祥伍志偉*張錄梅金 華劉永琦 薛 娜顏春魯孫文平

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州730000； 3.敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州730000； 4.甘肅省腫瘤醫院腹外二科，甘肅 蘭州 730000）

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居世界癌癥死亡率的第4 位，在男性癌癥死亡率中位居第2 位，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌中的主要亞型，約占75%～85%［1］。目前，肝癌的臨床治療多采用外科切除和放化療措施，但外科切除常因多發灶及轉移的發生導致HCC 患者的死亡率較高，放化療后可出現中性粒減少、貧血、腹瀉、手足皮膚反應等不良癥狀，從而導致患者的生存質量降低［2?3］。

奧沙利鉑（L?OHP）為一類具有體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性的廣譜抗癌藥物，但在臨床治療過程中產生的多種不良反應嚴重制約了其應用。已有研究表明，中醫藥辨證施治、扶正祛邪、陰平陽秘等整體理念與西醫的局部治療理論互補，在增強西藥療效、降低毒副作用、提高機體免疫力等方面有獨特的優勢［4?6］。因此，中西醫聯合治療肝癌或許能達到優勢互補和標本兼治的效果，對提升患者的生存率和改善生存質量有重要意義。本實驗選用貞芪扶正顆粒與奧沙利鉑聯合，經常規觀察、瘤體檢測、病理檢查等方法進行療效分析，全自動蛋白電泳和qPCR 檢測Bax、Bcl?2 腫瘤相關分子，這將為揭示聯合用藥治療肝癌的分子機制、拓展該中成藥的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 貞芪扶正顆粒（甘肅扶正藥業科技股份有限公司，批號K20180536）；注射用奧沙利鉑（齊魯制 藥有限公司，批 號2A2E16120138）；Bcl?2 鼠源性一抗（美國Imuno Way 公司，批號B4101）；Bax 兔源性一抗（美國GeneTex 公司，批號39988）；GAPDH 兔源性一抗（美國GeneTex 公司，批號42977）；EZ Standard PACK 1（美國Proteinsimple 公司，批號88335）；Anti?Rabbit Detection Module（美國proteinsimple 公司，批號17404）；Jes／Wes Separation 12?230kDa（美國proteinsimple 公司，批號20933）；Jess／Wes Separation 12?230kDa（美國proteinsimple 公司，批號20933）；10× Sample Buffer（美國proteinsimple公司，批號 86719）；Wash Buffer（美國proteinsimple 公司，批號86532）；Real Time qPCR試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號AI82513A）；TRIzol（美國 ambion 公司，批號175702）；Nuclease?Free Water（美國Promega 公司，批號0000070302）；反轉錄試劑盒（美國Promega 公司，批號0000366052）。

1.2 儀器 BX61 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；1?14K 高速低溫冷凍離心機（德國Sigma 公司）；DW?86L626 超低溫冰箱（青島海爾電器有限公司）；CP214 精密電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；WS?2932 proteinsimple Wes（美國Santa Clara 公司）；S1000TM 逆轉錄儀、BIOMATE 3S 核酸蛋白測定儀、iMARK 酶標儀（美國Bio?Rad 公司）；EG1150 石蠟包埋機、CM3050 組織切片機（德國Leica 公司）。

1.3 細胞 H22肝癌細胞株，由甘肅中醫藥大學甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室惠贈。

1.4 動物 SPF 級KM 雄性小鼠72 只，體質量（20±2）g，購自甘肅中醫藥大學科研動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2015?0002，實驗動物使用許可證號SYXK（甘）2015?0005，飼養于相對濕度45%～55%，溫度21～25 ℃的環境中，以標準鼠飼料及無菌水飼養。

1.5 方法

1.5.1 模型構建 參照文獻［7］ 報道，將體外增殖的H22肝癌細胞以無菌PBS 稀釋至1×105／mL，取200 μL 經腹腔注射接種于小鼠體內；馴化培養后抽取腹水細胞，無菌生理鹽水稀釋至2×106／mL；抽取細胞懸液100 μL，采用皮下注射法接種于小鼠前肢右側腋下。

1.5.2 分組與給藥 72 只SPF 級KM 種小鼠在動物實驗室適應性飼養3 d 后，隨機分為空白組、模型組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組。除空白組外，其余各組按“1.5.1”項下方法建立H22移植瘤小鼠模型。待瘤體達到100～300 mm3（植瘤第3 天）后開始給藥。取貞芪扶正顆粒溶于無菌水中，奧沙利鉑凍干粉溶于葡萄糖水注射液中，空白組正常飼養，模型組以0.1 mL／10 g 無菌水灌胃（1 次／d），并以0.1 mL／10 g 葡萄糖注射液腹腔注射（1 次／2 d），奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組以10 mg／kg 腹腔注射奧沙利鉑（1 次／2 d），奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組同時分別以0.026、0.013、0.007 g／kg 貞芪扶正顆粒溶液灌胃（1 次／d）。

1.5.3 體質量測定 造模完成后，于給藥前及給藥后5、10 d 固定時間段內，分別稱取小鼠體質量，計算其變化。

1.5.4 瘤體測量、抑瘤率測定 游標卡尺測量給藥前及給藥后5、10 d 各組小鼠瘤體長徑a（mm）和短徑b（mm），以公式V＝ab2／2 計算腫瘤體積（V）。末次給藥24 h 后處死小鼠，剝離瘤體組織，稱重并計算藥物抑瘤率，公式為抑瘤率＝ ［（對照組平均瘤質量－治療組平均瘤質量）／對照組平均瘤質量］ ×100%。

1.5.5 脾臟質量及指數測定 末次給藥24 h 后處死小鼠，剝離脾臟組織，生理鹽水漂洗、稱重，計算脾臟指數，公式為脾臟指數＝脾臟質量／小鼠體質量。

1.5.6 瘤體Bcl?2、Bax 免疫組化分析 石蠟切片經脫蠟與水化、內源性過氧化物酶清除、抗原修復、一抗與二抗孵育、DAB 顯色等過程后，具體參照文獻［8］，置于200 倍光鏡下檢測，以細胞核或細胞質中出現黃褐色者為陽性。

1.5.7 瘤體Bcl?2、BaxmRNA 表達檢測 稱取0.1 g 瘤體組織，應用TRIzol 法提取RNA，微量分光光度法檢測RNA 含量與純度，qPCR 法檢測瘤體組織中Bcl?2、BaxmRNA 表達，具體操作參照日本 TaKaRa公司qPCR 試劑盒說明書。以GAPDH 為內參，采用2—△△Ct法計算Bcl?2 和Bax基因mRNA 的相對水平，每組設4 個重復，6 個平行實驗。引物由杭州科寶生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.5.8 瘤體Bcl?2、Bax 蛋白表達檢測 稱取瘤體組織0.1 g，剪碎，加入組織裂解液，勻漿，4 ℃靜置15 min，每5 min 渦旋振蕩30 s，離心后取上清分裝，BCA 法測定蛋白濃度，具體操作參照BCA 試劑盒說明書。Wes 全自動蛋白分析系統檢測瘤體組織中Bcl?2、Bax 蛋白表達，具體操作參照試劑盒說明書；以GAPDH 為內參，應用Image J軟件測算灰度值，對比分析瘤體組織中Bcl?2 和Bax 蛋白的相對表達。

1.5.9 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間兩兩比較采用One way ANOVA 中的LSD 法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量 給藥后5、10 d，模型組小鼠體質量增速明顯高于奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組（P＜0.05），5 d 增幅大于10 d；空白組較模型組增重緩慢（P＞0.05）；奧沙利鉑組與奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組間及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組與奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組間體質量增幅無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠體質量（， n＝12）Tab.2 Body weights of mice in various groups（， n＝12）

表2 各組小鼠體質量（， n＝12）Tab.2 Body weights of mice in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

2.2 瘤體體積 給藥后5 d，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組較模型組瘤體體積增速慢（P＜0.05），與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組體積較?。≒＜0.05）。給藥后10 d，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組小鼠瘤體體積明顯小于模型組（P＜0.05），其中奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組小鼠瘤體體積小于奧沙利鉑組（P＜0.05）；藥物組瘤體體積依次為奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組＞奧沙利鉑組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組，見表3。

表3 各組小鼠瘤體體積（， n＝12）Tab.3 Tumor volume of mice in various groups（， n＝12）

表3 各組小鼠瘤體體積（， n＝12）Tab.3 Tumor volume of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

2.3 瘤體質量、抑瘤率 奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體質量低于模型組（P＜0.05）；奧沙利鉑組瘤體質量高于奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組（P＜0.05）；奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組抑瘤率均高于奧沙利鉑組，見表4。

表4 各組小鼠瘤體質量、抑瘤率（， n＝12）Tab.4 Tumor weights and tumor inhibition rates of mice in various groups（， n＝12）

表4 各組小鼠瘤體質量、抑瘤率（， n＝12）Tab.4 Tumor weights and tumor inhibition rates of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

2.4 脾臟質量及指數 空白組，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組脾臟質量和脾臟指數低于模型組（P＜0.01）；空白組與奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組比較，依次為奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組＞奧沙利鉑組，但組間無明顯變化（P＞0.05），見表5。

表5 各組小鼠脾臟質量及指數（， n＝12）Tab.5 Spleen weights and indices of mice in various groups（， n＝12）

表5 各組小鼠脾臟質量及指數（， n＝12）Tab.5 Spleen weights and indices of mice in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01。

2.5 瘤體Bax、Bcl?2 蛋白表達 如圖1～2 所示，與模型組比較，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中、低劑量組均上調（P＜0.05）；奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組上調極明顯（P＜0.01）。Bcl?2 在奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體組織中表達均較模型組低，其中奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組更明顯（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠瘤體Bax 蛋白表達（IHC，×200）Fig.1 Bax expressions in tumor tissues of mice in various groups（IHC，×200）

2.6 瘤體Bax、Bcl?2 mRNA 表達 與模型組比較，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體組織中Bcl?2 mRNA 表達下降（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中劑量組瘤體組織Bcl?2 mRNA 表達降低（P＜0.05），而Bax的mRNA 表達在奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組中升高（P＜0.05），見表6。

表6 各組小鼠瘤體Bcl?2、 Bax mRNA 表達（， n＝12）Tab.6 Bcl?2 and Bax mRNA expressions in tumor tissues of mice in various groups（， n＝12）

表6 各組小鼠瘤體Bcl?2、 Bax mRNA 表達（， n＝12）Tab.6 Bcl?2 and Bax mRNA expressions in tumor tissues of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

圖2 各組小鼠瘤體Bcl?2 蛋白表達（IHC，×200）Fig.2 Bcl?2 expressions in tumor tissues of mice in various groups（IHC，×200）

2.7 瘤體Bax、Bcl?2 蛋白表達 與模型組比較，各治療組瘤體組織中Bcl?2 蛋白表達下降（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組瘤體組織中Bcl?2 蛋白表達下降（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組Bax 蛋白表達升高（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中劑量組瘤體組織中Bax 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖3，與“2.6”項下結果一致。

圖3 各組小鼠瘤體Bcl?2、Bax 蛋白表達Fig.3 Bcl?2 and Bax protein expressions in tumor tissues of mice in various groups

3 討論

在中醫理論中，肝癌病因多樣，病機復雜。根據其臨床癥狀，可將肝癌歸納于“積聚”的范疇。積者有形，《醫宗必讀》 中說：“積之成者，正氣不足，而后邪氣距之。”其病機為臟腑正氣不足，內被七情所困，外有六淫所擾，多種病因交相互結，致氣滯痰凝，熱毒痰蘊，進而導致陰陽失調，氣血逆亂，日久成積，化成腫瘤。此說正如《內經》 中“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”的觀點。肝臟體陰用陽，邪氣耗傷肝中陰液，導致肝風化熱，熱熾津傷，煉液成痰，痰凝日久，積而成瘤。有現代醫家提出了“陰虛癌毒”的假說［9］，根據癌細胞過度異常增生的屬性將癌毒歸于陽亢的范疇，陰虛不能制約亢陽，輕陽壅盛，蘊久而化為癌毒。貞芪扶正顆粒由女貞子、黃芪2 味藥組成，可以扶助人體正氣，符合金元大家張元素的“養正積自除”的思想。女貞子最先記載于《神農本草經》，其性涼，味甘、苦，歸肝、腎經，有益肝腎之陰的功效?！恫荼窘浭琛?中說：“女貞子氣味俱陰”，是補陰要品。黃芪在《神農本草經》 中被列為“上品”，明代醫家李時珍稱其為“補藥之長”。其性微溫，味甘，歸肺、脾經，有補氣升陽，益氣固表，利水消腫，脫瘡生肌的功效。二藥相須為用，有益氣滋陰的功效。本研究以此為理論指導，選擇滋陰扶正類中藥——貞芪扶正顆粒與具有體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性的奧沙利鉑聯合，以增強奧沙利鉑的抗腫瘤活性和減少其骨髓抑制等毒副作用。通過常規觀察、小鼠體質量、脾臟質量、瘤體體積、抑瘤率等相關指標分析，提示在H22肝癌模型小鼠實驗中貞芪扶正顆粒具有輔助奧沙利鉑增效減毒的作用。

課題組對黃芪活性成分進行了大量的研究。已有研究表明，黃芪多糖可以上調白介素IL?1α、IL?2、IL?6、Bax 等的表達和下調IL?10、Bcl?2 等的表達，提高脾臟指數和胸腺指數，對H22肝癌小鼠有明顯的抗腫瘤作用［7］；黃芪甲苷可抑制HCC 細胞的上皮?間質轉化和遷移，下調lncRNA?ATB 表達使IL?11／STAT3 信號失活，從而誘導HCC 細胞發生凋亡［10］?，F代藥理研究發現，女貞子補腎陰，具有抗骨髓抑制的功效，其活性成分紅景天苷、多糖、齊墩果酸等具有抗腫瘤的功能［11］，其乙醇提取物通過調節Bcl?2、Bax、caspase?3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、TIMP2（組織抑制因子）、基質金屬蛋白酶MMP?2 及MMP?9 的表達來抑制細胞的遷移和侵襲，亦可通過PTEN（磷酸酶基因）的DNA 去甲基化來抑制PI3K／Akt 磷酸化，從而抑制肝癌的生長［12］。Bcl?2 和Bax 具有控制線粒體膜的通透性從而調控肝癌細胞凋亡的作用［13?14］，二者功能相互對立，如同中醫理論中的正氣與邪氣——正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛。本實驗研究發現，與奧沙利鉑組比較，貞芪扶正顆粒與奧沙利鉑聯合用藥后的抑瘤效果顯著，其中高劑量組抑瘤效果最為明顯，提示貞芪扶正顆?？梢暂o助提高奧沙利鉑的療效，且貞芪扶正顆粒的劑量越大，抑瘤效果越明顯。在奧沙利鉑治療后，小鼠的體質量下降，脾臟功能也受到損傷，而貞芪扶正顆粒對小鼠的體質量、脾臟有明顯保護的作用，且與給藥劑量呈正相關。此外，貞芪扶正顆?？梢燥@著下調Bcl?2 的蛋白基因表達，上調Bax 的蛋白基因表達，同樣與給藥劑量呈正相關性，提示奧沙利鉑聯合貞芪扶正顆?？赡芡ㄟ^改善Bcl?2 與Bax 的表達來提升正氣，從而抵抗邪氣，最終達到抑制肝癌的效果。