枯草芽孢桿菌L1-21在柑橘上的定殖能力及其防治綠霉病效果

李健，何鵬飛，李詠梅，吳毅歆，何鵬搏， 孔寶華，李興玉，MUNIR Shahzad,何月秋

1.云南農業大學植物保護學院，昆明 650201； 2.云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛存在，且較安全[1]，其發酵產品易于運輸貯藏、貨架期長，是目前注冊并商業化生產使用最多的生防菌劑[2]，在替代或減少化學農藥使用、保護環境、維護生態平衡、物種多樣性和農業可持續發展中發揮著越來越重要的作用[3]，如植物病害防治[4]、植物促生長[5-6]、采后果實病害防控及保鮮[7]等方面，均有報道。枯草芽孢桿菌L1-21(下稱L1-21)是一株來自溫州蜜柑“新津”品種的內生菌，它對柑橘黃龍病菌有較好的抑制效果[8]，對多種常見病原細菌及真菌都有顯著抑菌活性，且能定殖于多種作物體內[9]，應用潛力巨大。為了更好地在田間應用該菌株并為施用方法提供理論依據，筆者開展了枯草芽孢桿菌L1-21進入柑橘葉片、果實的速度及其防治果實綠霉病效果的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及培養基

供試菌株為L1-21的綠色熒光標記菌株L1-21-GFP，來自筆者所在實驗室。該菌株熒光標記穩定性好，生長速度和代謝特性及防控病害能力與野生型相同。綠霉病病原菌(Penicilliumdigitatum)為實驗室自主分離并保存。柑橘植株為溫州蜜柑“新津”，生長于大棚溫室。柑橘果實品種為新津、砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙,均購于農貿市場。

L1-21-GFP培養于LB液體和固體培養基，綠霉病菌培養于馬鈴薯蔗糖液體(PS)和固體培養基(PSA)。

1.2 L1-21-GFP的培養

從-80 ℃冰箱取出L1-21-GFP甘油保存菌，待其呈熔融狀態后，劃線接種到含氯霉素(終質量濃度為10 μg/mL，下同)的LB瓊脂培養基平板中，37 ℃過夜培養。次日，挑取單菌落于三角瓶中，在35 ℃、160 r/min條件下振蕩培養3 d，在含有氯霉素的LB瓊脂平板上培養并確定培養液中細菌濃度。

1.3 L1-21-GFP進入葉片時間與定殖量測定

將L1-21-GFP菌株濃度調至106cfu/mL，晴天下午18:30噴施于柑橘植株葉片，接種量以葉面無液滴下滑為度。分別于全株噴施結束后的10 min、20 min、30 min、40 min、1 h、4 h、6 h、8 h、18 h、22 h以及48 h，每次隨機采集3片葉。按采樣時間分別裝入保鮮袋中，立即放入4 ℃冰箱貯存或放置冰上。實驗室內用千分之一的分析天平稱量出葉片的質量，在A4白紙上臨摹葉片，在葉片形狀中標注編號，剪下葉片留下的形態，稱量紙片質量，按照A4紙單位質量面積(142.85 cm2/g),計算出葉片面積(S)，并做好數據的記錄。對于各時間段所采集的葉片，用3 mL的無菌水漂洗，回收漂洗液后按10倍梯度稀釋，取200 μL漂洗稀釋液在含有氯霉素的LB瓊脂培養基平板上涂布。37 ℃培養24 h后統計平板上的菌落數，計算出菌體的單位葉面積濃度(cfu/cm2)。

將上述使用無菌水漂洗過表面的柑橘葉片置于1%(有效氯)NaClO溶液中消毒2 min、75%乙醇溶液中消毒2 min以殺死葉表微生物。無菌水漂洗4次，用無菌吸水紙吸干表面殘余水分，轉移至無菌研缽內。按照葉片質量加入無菌水，仔細研磨成勻漿狀，按10倍梯度稀釋，隨后取200 μL葉肉組織研磨稀釋液，在含有氯霉素的LB瓊脂培養基平板上涂布，37 ℃培養24 h后統計平板上的菌落數，計算出菌體在葉肉內的單位面積濃度(cfu/cm2)。

1.4 L1-21-GFP在柑橘植株上向下傳導能力測定

噴施3株樹(3重復)，每株頂部單梢噴施約10片葉，并做好記錄，用報紙和紙袋(塑料袋)包裹其他葉片，以防被污染。分別于單梢噴施結束后的1、2、8、16、22、30 h，每株樹上、中、下各取1片未噴施的葉片，余下操作步驟同本文“1.3”。

1.5 L1-21-GFP在柑橘果實內的定殖試驗

1)L1-21-GFP在本主寄主果實中的定殖試驗。L1-21-GFP的培養方法同本文“1.2”一致，濃度調整為108cfu/mL，選擇大小適宜、色澤均勻的新津柑橘果實，自來水沖洗表面2 min后用吸水紙吸干，用75%乙醇消毒2 min后無菌水漂洗4次，并用無菌濾紙吸干，分別噴施菌液及浸泡L1-21-GFP處理1、5和10 h，取出后，用無菌濾紙吸干，無菌下各稱取1 g果皮和果肉，分別加入9 mL無菌水研磨成勻漿，按10倍梯度稀釋，取200 μL稀釋液涂布于含有氯霉素的LB瓊脂培養基平板上,余下操作步驟同本文“1.3”。試驗進行3次重復，每次重復使用18個果實，計算菌含量。

2)L1-21-GFP在不同品種柑橘果皮及果肉內的定殖。所選品種為砂糖橘、塘房橘、沃柑、椪柑、清香橘及冰糖橙，果實的消毒處理同本文“1.5 1)”，L1-21-GFP濃度為108cfu/mL，果實浸泡30 min后取出放置于37 ℃培養箱，并在培養后的6、24及48 h于無菌條件下分離果皮及果肉，余下步驟同本文“1.5 1)”。

1.6 L1-21-GFP對綠霉病的防效測定

選用砂糖橘果實按本文“1.5”消毒及浸泡，L1-21-GFP濃度為108cfu/mL，果實浸泡30 min后取出，并在其赤道附近用針刺法刺一直徑約3 mm、深度約5 mm的小洞，接入20 μL綠霉病菌孢子液，濃度為102cfu/mL，放入25 ℃恒溫培養箱培養，在處理后3 d和5 d時統計果實發病率，并計算防效，以浸泡液體LB的果實為對照，3次重復，每個重復90個果實。

1.7 數據處理與分析

L1-21-GFP的定殖數據用Excel及IBM SPSS Statistics 20.0軟件做統計分析，采用 Duncan’s 新復極差法進行多重比較(P<0.05)，用GraphPad Prism 制圖。

2 結果與分析

2.1 L1-21-GFP進入葉片時間與定殖量

整體來看(表1)，L1-21-GFP的定殖數量呈現逐漸增長的趨勢。葉肉中的定殖數量從10 min到48 h逐漸增加，10 min在葉肉內定殖數量為8.08×102cfu/cm2，48 h時定殖數量達到1.43×104cfu/cm2；L1-21-GFP在葉表的定殖呈現先增加后降低再增加后趨于穩定的趨勢，從10 min到40 min菌含量逐漸增加，10 min時定殖量為1.36×103cfu/cm2，1 h時其定殖量降低為1.81×103cfu/cm2，隨后逐漸增加，到8 h時定殖量達1.97×104cfu/cm2，18 h時雖有降低，但其菌含量亦達到1.39×104cfu/cm2，至22～48 h，定殖量變化不大。

表1 葉片中L1-21-GFP的定殖數量 Table 1 Colonization number of L1-21-GFP in leaves cfu/cm2

2.2 L1-21-GFP在柑橘植株上向下的傳導能力

頂部單梢噴施，檢測下部未噴施的葉片，結果顯示L1-21-GFP在葉表中的定殖量變化較為平穩(表2)，其范圍在1.51×102cfu/cm2(1 h)到4.29×102cfu/cm2(2 h)之間；在葉肉中，1 h取樣時，L1-21-GFP的定殖量為0，從2 h到30 h，定殖量逐漸增加，30 h定殖量達到1.15×103cfu/cm2。

表2 L1-21-GFP向下傳導到葉片的數量 Table 2 The number of L1-21-GFP transmitted downward to leaves cfu/cm2

2.3 L1-21-GFP在柑橘果實內的定殖量

1)L1-21-GFP在本主寄主果實中的定殖量。L1-21來自早熟溫州蜜柑品種新津(本主寄主)。噴施及浸泡新津果實處理證明L1-21-GFP能在新津果實內定殖(表3)；在噴施處理下于不同時間段取樣，L1-21-GFP在果皮中比果肉中的定殖量高，但各自在3個時間段里無顯著差異。在浸泡處理中，果皮中菌量大于果肉。在1 h后L1-21-GFP在果皮內和果肉中的定殖量分別為3.51×104cfu/g和9.51×103cfu/g，與浸泡5 h及10 h處理果實無顯著性差異，即處理果實浸泡1 h，L1-21-GFP菌量達到每克組織103～104cfu。

表3 L1-21-GFP在新津果皮及果肉內的定殖數量 Table 3 Colonization number of L1-21-GFPin peel and pulp of Citrus cv Xinjin

2)L1-21-GFP在不同品種柑橘果皮及果肉內的定殖量。采用不同品種的柑橘果實浸泡30 min，取出置于37 ℃溫箱培養，在6、24及48 h檢測果皮及果肉內L1-21-GFP的含量的結果(表4)顯示：L1-21-GFP均能在不同柑橘品種果實內定殖，但是不同品種間，其定殖能力存在差異；在培養6～48 h，L1-21-GFP在椪柑果皮中定殖量最高，達到3.67×103～2.03×104cfu/g，其次是砂糖橘2.22×103～1.88×104cfu/g；總體上隨著培養時間延長，定殖的菌量有所增加，但至24 h后，果肉中的定殖量略高于48 h，但差異未達顯著水平。

表4 L1-21-GFP在不同柑橘果實中的定殖數量 Table 4 Colonization number of L1-21-GFP in different Citrus varieties fruits 102 cfu/g

3)L1-21-GFP對綠霉病的防效。先接種L1-21后接種綠霉菌，3 d和5 d時統計防效結果(表5)。由表5可見，處理3 d后，空白對照81.67%果實顯癥，已出現少量綠霉，而以L1-21-GFP處理的果實未出現綠霉癥狀，防效100%；處理5 d后，空白對照96.39%果實顯癥，以L1-21-GFP處理的果實18.88%顯癥，防效達80.36%。本結果是依據果實發病率(圖1)來計算的，如果按發病面積來計算，所得到的防效應該更高。

表5 L1-21-GFP防治柑橘果實綠霉病的效果 Table 5 Control effect of L1-21-GFP on citrus green mold %

A.處理組3 d； B.對照組3 d； C.處理組5 d； D.對照組5 d。A.Treatment after 3 d; B.Negative control after 3 d; C.Treatment after 5 d; D.Negative control after 5 d.

3 討 論

枯草芽孢桿菌作為一種重要的生防資源，可在植物根際土壤、根系及地上部組織等多個位置定殖。殷幼平等[10]研究結果表明噴施后立即測定，CQBS03-p HY43G在柑橘葉片上的定殖數量最高為6.80×104cfu/g，而后從0 d到42 d菌株定殖量逐漸下降；為有效排除其他細菌對枯草芽孢桿菌L1-21定殖計數結果的干擾，本研究選用了106cfu/mL濃度的枯草芽孢桿菌L1-21的綠色熒光標記菌株，結果證明該菌株可迅速在柑橘葉片內定殖，10 min定殖量分別為1.36×103cfu/cm2(葉表)和8.08×102cfu/cm2(葉肉)，究其原因一方面可能是L1-21菌株作為柑橘內生細菌，與寄主植物有天然的良好互作共生關系，與異源寄主內生菌相比，宿主內生細菌的快速定殖易于其搶占有利的生態位點，為發揮高效的生防作用奠定基礎；另一方面噴施接種時間為晴天傍晚18：30，菌株受到溫度、濕度、紫外線等環境因素變化的影響較小，這可為指導田間的使用提供依據。不同于殷幼平等[10]的報道，我們發現L1-21在柑橘葉片上呈現持續增長的趨勢，如48 h定殖數量是10 min的17.69倍(葉肉)和19.71倍(葉表)，這或許與取樣時間長短及菌株本身的定殖特性有關。葉肉中L1-21定殖量穩定增長的趨勢說明葉肉更適合其定殖，而葉表中18 h出現降幅可能與接種后次日白天所受環境因素的變化有關[11]。金勤等[12]在油茶上通過葉部噴施Y13UV-GFP菌懸液，發現Y13UV具有向下傳導的能力。本次頂部單梢噴施試驗中，也得出相同的結論。另外，L1-21-GFP向下傳導到葉表的定殖量趨于穩定，暗示其對葉表復雜的微環境有較強的適應性，而傳導到葉肉后所呈現的菌含量不斷增加的趨勢，則可能與其在葉肉內的生長繁殖有關。但L1-21-GFP傳導到葉表及葉肉內的定殖數量較低，或許與低接種量(106cfu/mL)及其在柑橘葉面上的潤濕、黏附、滲透等有關。因此田間使用時，建議提高L1-21的接種濃度，并輔以適量的表面活性劑，降低噴霧液滴的表面張力，充分潤展，延長其在柑橘葉片上的保濕及滯留時間[13]，以進一步提升菌株的葉片定殖能力。

基于安全性及對果實品質的延續性，枯草芽孢桿菌作為公認的食品工業中應用的安全微生物[14]，被逐漸應用于采后果實的保鮮及病害防控[15-16]。直接浸泡油桃果實的試驗結果顯示枯草芽孢桿菌BS-331可顯著抑制油桃果實采后病害的發生，且其防效與納他霉素(300 mg/L)相當[17]。陳欣怡等[18]用枯草芽孢桿菌9407菌懸液浸泡蘋果，發現菌株能在果實內部定殖，但近表皮處果肉中的定殖量顯著高于近果心果肉中的定殖量。本研究也證實L1-21不僅能定殖于來源寄主(本主)新津，還能在其他柑橘品種上定殖，顯示出良好的應用潛力。其中在浸泡處理0.5 h后，L1-21的定殖能力更強。此外，研究還發現L1-21在果皮內的定殖能力優于果肉。整體來看(表4)，柑橘浸泡后的6～24 h是生防芽孢桿菌L1-21菌株在果皮中的急速生長期：24 h定殖量與6 h相比，砂糖橘增長5.23倍，塘房橘增長4.16倍，椪柑增長3.63倍，清香橘增長3.29倍，沃柑增長1.48倍。L1-21在不同果實內定殖能力的差異，或許與品種本身的形態及生理生化等特征(果皮厚度、果皮細胞間隙及果肉含糖量等)相關。

最近，L1-21菌株被證實可有效防治番茄采后病害——灰霉病[7]，更早時有利用解淀粉芽孢桿菌DH-4成功防治柑橘采后病害——綠霉病的成功報道[19]。在本研究中，L1-21-GFP對柑橘綠霉病菌的平板抑菌圈直徑為37.02 mm(結果未列出)，浸泡處理果實30 min，注射接種綠霉病菌孢子和只記錄發病率的條件下，該菌株對果實綠霉病的防效3 d為100%、5 d為80.36%，說明L1-21對柑橘果實綠霉病的防控也有著廣闊的應用前景。

枯草芽孢桿菌L1-21是一株能高效抑制柑橘黃龍病的柑橘內生細菌，本研究結果對拓展其應用范圍、田間應用技術方法及應用前景具有指導意義，但大田條件下的菌體細胞定殖量對黃龍病的防效以及后續貯藏期果實綠霉病發生之間的關聯性還有待進一步證實。