苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性及生防效果

呂亮，陳嬌 ，郭志敏，呂為，陶佩文 ， 呂惠紅 ，潘哲群，常向前，萬鵬，張舒

1.農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室/湖北省農業科學院植保土肥研究所，武漢 430064；2.武漢武大綠洲生物技術有限公司，武漢 430072；3.華中農業大學植物科學技術學院，武漢 430070

草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是2019年首次由緬甸遷入我國的雜食性遷飛害蟲，并迅速擴散至我國26個省市區的1 518個縣，已嚴重威脅我國的糧食安全[1]。迄今在草地貪夜蛾的防治策略中，控制草地貪夜蛾的暴發為害仍依靠于化學農藥的大量使用。而化學農藥的過度施用，極易造成害蟲抗藥性、再猖獗以及環境殘留和污染等一系列嚴重的問題，嚴重制約了現代農業的可持續發展。因此，采用生物防治方法或生物農藥替代化學農藥來控制草地貪夜蛾越來越重要，并日益受到重視[2-3]。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是從苜蓿銀紋夜蛾幼蟲中分離出的1株多粒包埋的核型多角體病毒[4]，它能交叉感染甜菜夜蛾、小菜蛾、銀紋夜蛾、斜紋夜蛾等30多種鱗翅目害蟲[5]，以Bt等多種殺蟲劑和非靶標害蟲病毒作為增效劑的混配劑型對許多夜蛾科害蟲具有明顯的增效作用，并進一步拓寬了殺蟲譜，提高了殺蟲效果[6-7]。苜核·蘇云菌懸浮劑是武漢武大綠洲生物技術有限公司研發的昆蟲病毒新型生物農藥，由苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒加入Bt高效病毒增效劑復配而成，具有良好的殺蟲活性，已在蔬菜、果樹、水稻等大面積應用[8]。

本研究通過室內活性測定、田間試驗等方法檢測和評價苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾的殺蟲活性和生防效果，以期為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒在玉米草地貪夜蛾的生物防治中得到廣泛應用提供數據支撐，最終為苜核·蘇云菌懸浮劑在防治草地貪夜蛾上的登記應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試病毒、生物藥劑

供試病毒為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)。2019年5月20日于湖北省仙桃市玉米田采集草地貪夜蛾，在武漢武大綠洲生物技術有限公司于室內進行病毒感染篩選試驗(其中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲具有較高的感染活性)，并用飼養的草地貪夜蛾幼蟲進行增殖擴繁。將感染病毒的幼蟲尸體加水研磨，經3層紗布過濾，濾液經600 r/min和3 000 r/min差速離心，顯微計數為每mL含有1.8×1010個病毒多角體 (polyhedral inclusion body,PIB)，即得較純的多角體病毒母液(記濃度為1.8×1010PIB/mL)，于低溫保存備用。

供試生物藥劑為苜核·蘇云菌懸浮劑(1.0×107PIB/mL)。由武漢武大綠洲生物技術有限公司研制，并由其子公司武漢楚強生物科技有限公司生產。

1.2 供試昆蟲

供試昆蟲為草地貪夜蛾，在湖北省通山縣大畈鎮板橋村夏季玉米地，于2019年7月20日采獲草地貪夜蛾高齡幼蟲，帶回湖北省農業科學院植保土肥研究所實驗室，采用新鮮嫩玉米葉于一次性塑料培養皿(直徑8 cm，高3 cm)中單頭飼養。草地貪夜蛾的室內飼養條件為：(25±1) ℃，相對濕度60%～70%，光周期為16L∶8D。繁殖多代后留取新鮮并經消毒處理的卵塊備用。

1.3 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲的室內活性測定

本試驗設計了1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104等6個濃度梯度。即先將配制的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒母液倍數稀釋成 1.0×109PIB/mL，然后經多次10倍稀釋得到其他不同濃度的稀釋液。試驗設空白對照處理，共計7個處理，每處理重復3次。

試驗方法采用葉段喂毒法，即事先用病毒懸浮液噴霧處理新鮮玉米嫩葉段(長2 cm ×寬2 cm)，接入幼蟲進行飼喂，并用培養皿進行單頭飼養，飼養條件為：溫度(25±1) ℃，相對濕度60%～70%，光周期為16L∶8D。待含毒玉米葉段被取食完后，立即補充新鮮無毒玉米葉段。每重復處理48頭草地貪夜蛾2齡幼蟲。參考文獻[9-11]，綜合考慮該病毒在夜蛾科昆蟲細胞與寄主上增殖的變化，確定于接蟲后7、10 d調查因病毒死亡蟲數和總死亡蟲數，統計死亡率并計算LC50等數據。

1.4 1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑對草地貪夜蛾幼蟲的田間防效試驗

田間藥效試驗在湖北省通山縣闖王鎮小源村夏季玉米地進行。該試驗地塊總共1 500 m2，土質類型為石灰性泥土，pH值為6.8，有機質含量13.9%，肥力中等偏上。常年種植玉米，種植玉米品種為西玉三號，2020年7月13日施45%復合肥750 kg/hm2做底肥并播種。該田塊自2019年以來，草地貪夜蛾發生為害嚴重。

試驗共設計1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑(1 500 mL/hm2)、常用殺蟲劑15%甲維·茚蟲威懸浮劑(300 mL/hm2)以及空白對照 3個處理。每處理重復4次，共計12個試驗小區，每小區面積為100 m2。

于2020年8月26日(草地貪夜蛾低齡幼蟲多發期)近傍晚時一次噴霧施藥。使用樂幫手牌3WBJ-16DZ多功能背負式電動噴霧器，工作壓力0.40～0.60 MPa，噴孔口徑1 mm，流量60～85 L/h。施藥當日為晴天，氣溫23～32 ℃。于施藥后第1、3、5、7、10、15天調查。調查時，每小區取10個隨機樣點，每點連續調查10株，共計100株，記錄每株玉米上活蟲數、死亡數、中毒情況及天敵數量。相關計算公式如下：

防治效果=

1.5 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的分子鑒定

1) 供試病毒樣本。事先選取室內活性測定時的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒母液(記樣品1)、生物制劑1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑(記樣品2)、 田間藥效試驗后病毒感染蟲尸(記樣品3)、樣品3中采集的蟲尸感染的草地貪夜蛾第2代幼蟲蟲尸(記樣品4)作為供試病毒樣本，以驗證1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑中AcMNPV對草地貪夜蛾幼蟲是否具有殺滅活性。

2)DNA提取。取AcMNPV試樣1.0 mL，加入99.0 mL蒸餾水，充分振蕩1 min；取振蕩后的混懸液300 μL，加入100 μL 堿裂解液，于 37 ℃水浴30 min；再加入200 μL Tris·HCl緩沖液， 10 000 r/min離心8 min，取上清液于離心管中；加入5 μL蛋白酶K和60 μL SDS， 于65 ℃水浴2 h，取出冷卻至室溫；再加入650 μL Tris飽和苯酚混勻， 10 000 r/min離心5 min，取上清液于新離心管中；于轉入上清液的離心管中加入650 μL苯酚∶氯仿(體積比1∶1)混合液，10 000 r/min離心5 min，再取上清液于新離心管中；于上清液中加入650 μL氯仿∶異戊醇混合液(體積比24∶1)，10 000 r/min離心5 min，最后取上清液保存于新離心管中，并用分光光度計測定DNA濃度。

3)PCR擴增。采用T3 super mix標準體系：試樣DNA 2 μL，前后引物各0.5 μL，T3 super mix 18 μL和ddH2O 7 μL。PCR擴增條件為95 ℃，3 min預變性后，進行以下循環：98 ℃ 15 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，最后再72 ℃延伸5 min;循環42次。

4)DNA瓊脂糖凝膠電泳。取PCR擴增產物2 μL及5 kb DNA Marker點樣于瓊脂糖凝膠中，180 V電壓下電泳20 min。電泳結束后在凝膠成像系統中觀察PCR產物。

凝膠成像系統中觀察到分子質量大小正確的PCR產物，用polh、lef-8、lef-9基因PCR擴增引物對PCR產物進行DNA測序。各基因引物如下：

polh上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGGGCTGAGGATCCTTT

polh下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACTGGTGCAAACTCCTT

lef-8上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGCACGGCGAAATGAC

lef-8下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACATGTACGGATCTTCGGC

lef-9上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGAAAAACGGGTACGCGG

lef-9下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACTTGTCACCGTCGCAGTC

最后應用DNAMAN 6.0軟件對所測到的polh、lef-8、lef-9序列進行比對。

1.6 數據分析與處理

試驗數據應用IBM SPSS 22.0數據統計分析軟件進行處理。

病毒殺蟲活性測定試驗中統計各濃度處理死活蟲數，計算死亡率、校正死亡率并轉換成概率值，各處理濃度轉換成lg值，通過工作概率值及權重等計算得毒力回歸方程(slope ± SE)，求出LC50值及其95%的置信限，最后進行卡方(χ2)檢驗；田間防效試驗中，統計各處理活蟲數，計算蟲口減退率，用Microsoft Excel編輯公式求出防治效果，并采用Duncan’s法進行分析，用單因素方差分析比較處理間差異顯著性。

文中圖表均采用Microsoft Excel軟件進行制作。

2 結果與分析

2.1 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性

室內活性測定的結果(表1)顯示，處理7 d后，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾2齡幼蟲的LC50為4.1×107PIB/mL，LC90為1.05×108PIB/mL；而處理10 d后，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對2齡幼蟲的LC50為2.9×107PIB/mL，LC90為7.8×107PIB/mL。可見苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒處理草地貪夜蛾2齡幼蟲7 d后的LC50、LC90均高于10 d后的LC50和LC90，即7 d時苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲表現出較好的殺蟲活性。

表1 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾2齡幼蟲的生物測定 Table 1 Bio-activity of AcMNPV acts on the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda (Means ± SE)

2.2 苜核·蘇云菌對草地貪夜蛾幼蟲的田間防治效果

田間藥效試驗結果顯示，1千萬苜核·蘇云菌SC(1 500 mL/hm2)對草地貪夜蛾幼蟲起作用效果比較慢。在噴施用藥后第1、3、5天的平均防效分別為11.57%、16.23%、15.56%，用藥后第7天的平均防效也只有21.88%，但用藥后第10天的蟲口防效突然上升到68.99%，且用藥后第15 天的平均防效亦有66.87%。而對照化學藥劑15%甲維·茚蟲威SC(300 mL/hm2)對草地貪夜蛾幼蟲有很好的殺滅效果，能迅速降低蟲口數量，用藥后第1、3、5、7 天的平均防效分別為91.39%、92.66%、90.71%和87.19%，但其藥后第10 天的平均防效開始下降，僅為67.63%，且藥后第15天的平均防效已下降至51.60%。詳見表2。

同時我們也發現，空白對照區的蟲口減退率在處理后第1、3、5 天均為負數，即說明蟲口數量在增長，而在處理后第7 天開始變為正數(蟲口開始下降)，其第10 天和第15天 的平均蟲口減退率分別達到38.25%、47.00%，極有可能與第10～15 天后草地貪夜蛾的幼蟲有部分開始入土化蛹以及世代重疊等原因有關。

綜上可見，供試藥劑1千萬苜核·蘇云菌SC(1 500 mL/hm2)對草地貪夜蛾是有一定的防治效果的，但起作用較慢，發揮藥效約在第10～15 天。

表2 1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑對草地貪夜蛾幼蟲的田間試驗結果 Table 2 Control effect of the compounds of 107 PIB/mL AcMNPV + Bt suspension against the larvae of Spodoptera frugiperda %

2.3 苜核·蘇云菌對天敵的影響

田間試驗時，同時調查了1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑對玉米上害蟲天敵(蜘蛛、瓢蟲、隱翅蟲等)的影響，結果顯示，1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑對蜘蛛、瓢蟲和隱翅蟲等天敵未見有明顯的傷害作用，平均百株有各類天敵13.4頭，而對照化學農藥15%甲維·茚蟲威懸浮劑藥后對蜘蛛、瓢蟲和隱翅蟲等天敵則有明顯的毒殺作用，其藥后第1天調查時，平均百株玉米上僅為3.1頭，藥后第3 天調查每百株玉米上亦只有各類天敵5.2頭(圖1)。可見1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑對害蟲天敵有較好的保護作用，而15%甲維·茚蟲威懸浮劑對天敵的傷害相對較大。

圖1 1千萬苜核蘇云菌SC、15%甲維茚蟲威SC對天敵的影響Fig.1 The effect of 107 PIB/mL AcMNPV + Bt Suspension and Emamectin Benzoate+Indoxair Conditioningarb 15% Suspension on nature enemies of Spodoptera frugiperda

2.4 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的分子鑒定

不同供試病毒樣品的PCR擴增結果顯示，樣品1、2、3、4的polh、lef-8、lef-9擴增片段大小一致且正確，polh、lef-8、lef-9基因PCR產物的大小分別為0.540、0.716和0.290 kb (圖2)，即可證明AcMNPV對草地貪夜蛾幼蟲有殺蟲活性。

1:樣品1 Sample 1; 2:樣品2 Sample 2; 3:樣品3 Sample 3; 4:樣品4 Sample 4; M:DL 5 000標準 DL 5 000 marker.圖2 AcMNPV不同試驗樣品的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of different AcMNPV test samples

應用DNAMAN 6.0軟件對樣品1、2、3、4中的polh、lef-8、lef-9擴增片段進行序列比對，結果(圖3)表明，樣品1、2、3、4的polh、lef-8 、lef-9擴增序列間相似度均為100%，說明樣品1、2、3、4均來自于同一種病毒AcMNPV。

3 討 論

苜核銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是一種昆蟲桿狀病毒，害蟲通過取食感染病毒后，病毒會在昆蟲體內增殖擴繁，會陸續感染全身，最終導致死亡。本研究結果表明，苜核銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾幼蟲有較好的生物活性，其第7 天和第10 天的LC50分別4.1×107、2.9×107PIB/mL，且在田間表現出較好的防治效果，其混配的1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑(1 500 mL/hm2)藥后第10天、15 天的平均防效較好，分別達到68.99%和66.87%，且對天敵安全。因此應加快研發速度，以便AcMNPV 在草地貪夜蛾的生物防治中發揮更大的作用。武漢楚強生物科技有限公司生產的1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑是由AcMNPV與生物農藥蘇云金桿菌(Bt )復配而成的，可以顯著提高病毒的殺蟲活性。因為Bt是一種廣譜性殺蟲劑，具有較好的微生物殺蟲活性，當AcMNPV與Bt復配后，其毒力比單一型制劑應該有明顯提高，不僅擴大了Bt的殺蟲范圍，而且提高了其毒力，達到一種制劑防治多種害蟲的目的[12]，這也是1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑在蔬菜、果樹和水稻上能夠大面積推廣的原因所在。因此，1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑應可作為草地貪夜蛾綠色防控的防治藥劑在玉米上推廣。

圖3 應用DNAMAN 6.0軟件對polh、lef-8、lef-9基因進行序列比對結果Fig.3 Results of sequence alignment of polh,lef-8 and lef-9 genes were analyzed by DNAMAN 6.0 software

進行田間藥效試驗時，在空白對照區蟲口減退很快的情況下(第15天的蟲口減退率達到47.00%)，1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑(1 500 mL/hm2)在藥后第15 天的平均防效達到 66.87%，呈快速上升態勢，而化學農藥15%甲維·茚蟲威SC(300 mL/hm2) 藥后第15 天的平均防效卻下降至51.60%。雖然從“一升一降” 中可看出供試藥劑1千萬苜核·蘇云菌懸浮劑(1 500 mL/hm2)對草地貪夜蛾在第10～15 天時具有一定的防治效果，但考慮到生物農藥起效慢以及草地貪夜蛾幼蟲歷期短、世代重疊等原因，建議在進行生物農藥(特別是病毒制劑)田間藥效試驗時應酌情增加調查次數，延長調查時間，可能會取得更理想的試驗結果。這一點也是本研究的不足之處。總之，化學藥劑與生物藥劑相比，殺滅害蟲效果相對較高，起效快，應當作為害蟲暴發時的一種應急防治措施。而對于害蟲發生相對較輕時，生物農藥可代替化學農藥作為綠色防控技術措施之一，從而減輕環境污染，達到保護農業生態的效果。

另外，本研究中使用的polh(polyhedrin)基因是一類多角體蛋白啟動子，和p10是桿狀病毒表達載體系統(BEVS)中最常用啟動子，均在病毒感染晚期大量表達[13]。但p10啟動子的活性次于polh啟動子，因此，polh啟動子常被用于外源蛋白的表達。而基因lef-8能編碼病毒自身RNA聚合酶的最大亞基，是一類晚期表達因子[14]。lef-9是在桿狀病毒中與lef-4、lef-8和p47一起共同編碼蛋白聯合體亞基的一類晚期表達因子，研究發現，缺失lef-9基因病毒是不能生成具有感染活性的病毒粒子的，而補回lef-9基因病毒則可恢復病毒的感染活性，因此，lef-9 基因是桿狀病毒形成具有感染活性BV(budded virus)的必需基因[15]。可見，lef-8和lef-9基因在不同種類的核型多角體病毒中具有較高的保守性，故而lef-8和lef-9基因可作為鑒定病毒種類的依據。因此，本研究以polh、lef-8和lef-9為檢測對象，通過基因序列比對，同源性均達到100%，以分子快速檢測方式再次驗證了AcMNPV對草地貪夜蛾具有較好的殺蟲活性，適合在草地貪夜蛾防控中進一步推廣應用。

草地貪夜蛾自2019年入侵我國，已成為玉米重要害蟲，并在華南、西南部分地區形成定殖種群，給我國玉米產業造成巨大損失，嚴重威脅著我國的糧食安全[16]。面對當前草地貪夜蛾國內嚴峻的防控形勢，加快篩選和研發草地貪夜蛾防控的高效藥劑是當務之急[17]。雖然病毒殺蟲劑由于其作用速度慢、殺蟲譜窄等問題影響了其廣泛應用，但在日益重視生態、環境保護的背景下，桿狀病毒殺蟲劑由于其相對傳統農藥的顯著優勢，在農業生產上定會得到越來越廣泛的應用。而由于昆蟲病毒制劑極易受高溫、陽光、雨淋、害蟲蟲齡等外界條件影響[18]，故建議選擇在害蟲低齡幼蟲發生高峰期施藥，最好選擇在晴天16：00-17:00使用，避開高溫和光照等不利環境條件的影響，以使病毒制劑能更好地發揮作用，提高對害蟲的防治效果。