新梨7號及其親本果皮揮發性物質的比較分析

向思敏，劉園，王江波，邵建柱， 張紅艷，吳翠云，唐章虎，徐娟

1.園藝植物生物學教育部重點實驗室/華中農業大學園藝林學學院,武漢430070； 2.南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室/塔里木大學植物科學學院，阿拉爾843300；3.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，阿拉爾 843300；4.河北農業大學園藝學院，保定071000； 5.新疆農業科學院輪臺國家果樹資源圃，輪臺841600

早酥(PyrusbretschneideriRehd ‘Zaosu’)是以蘋果梨(P.bretschneideriRehd ‘Pingguoli’)為母本、身不知(P.communis‘Shenbuzhi’)為父本通過有性雜交培育的適應性極強的早熟梨品種，是雜交育種的優良骨干親本[1]。庫爾勒香梨(P.sinkiangensis‘Korla’)屬于新疆梨系統，原產新疆庫爾勒地區，是瀚海梨(P.sinkiangensis‘Hanhai’)和鴨梨(P.bretschneideri)的后代，其果實香味濃郁，汁多味甘[2]。新梨7號(P.sinkiangensis‘Xinli No. 7’)是塔里木大學于1985年以庫爾勒香梨作母本、早酥作父本經過有性雜交選育而成。在新疆阿克蘇地區表現為大果、綠皮、色澤鮮艷、多汁味甜且早熟[3]。新梨7號遺傳了父本的早熟性，且較其更早熟15～20 d；同時，遺傳了母本的優良品質性狀，如質地酥脆、耐貯、清香和陽面紅暈等，且較母本果實大、果心小[4]。

雜交育種可以將雙親不同的優良性狀傳遞給后代，在產量、生長發育特性、抗逆性、適應性和品質性狀的優化等方面均有很好的表現，提升香氣品質也是其中的研究熱點之一。怡人的香氣有利于吸引消費者購買水果，隨著國際市場對果實品質的要求越來越高，對水果中揮發性物質譜的研究也已成為果實品質的重要研究方向[5]。果實香氣物質成分主要包括揮發性的脂肪酸、氨基酸，以及由次生代謝產生的酯類、醇類、酮類、醛類、萜類和酚類化合物等[6-7]。葡萄中各揮發性物質含量在后代中呈廣泛分離，是多基因控制的數量性狀，而且香葉醇的表達在雜交后代中增強[8]。對甜瓜及其雜交后代的揮發性成分研究發現，大部分酯類化合物含量在F1代果實中居于雙親之間，且偏向于高值親本，而醛類、醇類及其他類化合物在F1代均表現為接近低值親本[9]。寒富蘋果(MaluspumilaMill ‘Hanfu’,母本)與四倍體嘎啦(M.pumilaMill ‘Gala’,父本)雜交產生的后代三倍體蘋果中果實品質均傾向于父本遺傳[10]。張文君等[11]對不同種間雜交梨果的揮發性成分進行SPME-GC-MS分析時發現，酯類、醛類、烷烴類、酮類、烯烴類及醇類物質的種類與含量決定了果實的香氣差異性。前期研究表明，庫爾勒香梨的揮發性物質以果皮中種類和含量為最高，其中醛類和酯類物質含量占總揮發性物質的90%[12-13]。

本研究采用HS-SPME-GC-MS方法，對庫爾勒香梨和早酥的雜交后代新梨7號的果皮揮發性物質進行評價和比較分析，旨在為后續探索梨果實芳香品質的形成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年8月1日于河北省保定市競秀區四臺村采集“新梨7號(河北)”商業成熟期果實。2018年8月10日于塔里木大學南疆特色果樹種質資源圃采集的“新梨7號(新疆)”、“庫爾勒香梨”和“早酥”，均為商業成熟期果實。鮮果運回后每5個果實為1組，共3組重復，用手術刀將果皮組織分離，于-80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器設備與試劑

氣相色譜質譜聯用儀TRACE GC U1tra結合DSQ II mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)，50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭(上海安譜實驗科技股份有限公司)，DTA-33超聲波清洗機(鼎泰(湖北)生化科技設備制造有限公司)，H1850R醫用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發公司)。

試劑來源：C10-C40正構烷烴混標(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；壬酸甲酯(色譜純，上海源葉生物科技有限公司)；氯化鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 HS-SPME-GC-MS檢測揮發性物質

梨揮發性物質的提取和檢測分析參照文獻[11]進行。

頂空-固相微萃取(HS-SPME)：將樣品研磨成粉末，取2.50 g置于15 mL頂空瓶中，加入5 mL 30% NaCl(m/V，含內標壬酸甲酯0.1 μL/100 mL)，加蓋密封；40 ℃水浴15 min，頂空吸附15 min。

氣相色譜-質譜(GC-MS)：色譜柱為TRACE TR-5 MS 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Scientific，Bellefonte，PA，USA)。載氣為高純氦氣(99.999%)，恒流模式，流速1 mL/min。離子源(70 eV)正離子掃描模式，掃描范圍45～400m/z。進樣口，離子源和傳輸線的溫度分別為 250、260 和280 ℃。升溫程序為40 ℃保持3 min，以 3 ℃/min 的速度升溫至160 ℃并保留 l min，然后以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保留1 min，最后以8 ℃/min的速度升溫至240 ℃并保留1 min，不分流模式。

通過匹配計算機質譜數據庫(NIST05)和計算保留指數[12]對揮發性物質進行定性分析，并采用內標法進行相對定量。

1.4 數據統計與分析方法

數據統計分析及柱形圖繪制采用Excel(MS office 2016,Microsoft,CA,USA)和GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)。差異顯著性分析利用SPSS(SPSS 20.0,IBM,NY,USA)的ANOVA程序進行。

2 結果與分析

2.1 新梨7號及其親本揮發性物質種類的變化

新梨7號及其親本中共檢測出119種揮發性成分，其中有酯類23種、烷烴19種、醇類17種、萜烯類16種、醛類14種、脂肪酸9種、芳烴9種、烯烴7種和酮類5種(因數據量較大，文中未列出)。

新梨7號中共檢測到55(新疆阿拉爾)和53種(河北保定)揮發性物質，父本早酥梨中有56種揮發性物質，母本庫爾勒香梨有100種(表1)。

與父本相比，新梨7號中的揮發性物質增加了19種，含醛類4種、萜烯類1種、醇類1種、烷烴3種、酯類5種、芳烴1種、烯烴1種和酮類3種；減少了9種，含萜烯類3種、醇類2種、脂肪酸1種、烷烴2種及芳烴1種。

與母本相比，新梨7號中的揮發性物質增加了11種，含醛類2種、萜烯類1種、烷烴1種、酯類2種、芳烴1種、烯烴1種和酮類3種。減少了41種，含醛類3種、萜烯類6種、醇類10種、脂肪酸8種、烷烴1種、酯類7種、芳烴3種及烯烴3種。

表1 新梨7號及其親本揮發性物質種類的變化 Table 1 Differences of volatile compounds between ‘Xinli No. 7’ and its parents

2.2 新梨7號及其親本不同種類揮發性物質含量對比

新梨7號揮發性物質總含量及大部分揮發性物質種類含量均介于父母本之間，僅酮類物質含量顯著高于其親本(圖1)。

就酮類物質而言，新梨7號較父本新增了2-庚酮、2-癸酮和2-十一烷酮，較母本新增了2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-癸酮和2-十一烷酮。6-甲基-5-庚烯-2-酮和2-壬酮的含量顯著高于其親本。

2.3 新梨7號及其親本不同種類揮發性物質譜對比

新梨7號及其親本的9類揮發性物質譜如圖2所示，新梨7號的揮發性物質相對含量分布與親代父本早酥之間具有更高的相似性。

4種梨果中醛類物質含量占總揮發物的58.04%～89.60%。新梨7號中比例高達87.30%和89.60%，與父本相似(87.75%)，約為母本的1.5倍。己醛、(E)-2-己烯醛、(E)-4-氧代己-2-烯醛、壬醛和癸醛是4種梨果中共有的揮發性化合物，提供青香味[14]。(E)-2-辛烯醛僅在新梨7號中檢出，具有清香味[15]。萜烯類物質具有一定的花香味[14]，共鑒定出9種萜烯類物質，4種梨果中萜烯類物質含量占總揮發物的0.87%～13.08%。新梨7號中占比為0.86%和1.00%，與父本的相對含量相似(1.23%)，僅為母本的0.06倍。醇類物質的含量占總揮發物的1.10%～9.46%。新梨7號中的醇類物質占比均接近低值親本父本早酥。酯類物質是提供果實主要香氣的物質之一，大多具有果香味。4種梨果酯類物質含量占總揮發物的0.92%～3.20%。在新梨7號梨果中(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸己酯含量較高，分別具有果香和藥草香(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。

4種梨果中脂肪酸類物質含量占總揮發物含量的0.02%～6.31%。新梨7號中脂肪酸占比低于雙親。苯甲酸是4種受檢梨果中唯一共有的脂肪酸類物質，新梨7號中的含量介于父母本之間。

其他揮發性物質種類中，新梨7號中芳烴相對含量顯著低于雙親，烯烴的相對含量介于父母本之間，而酮類的相對含量顯著高于雙親。

2.4 新梨7號及其親本主要揮發性成分的對比

對比新梨7號及其親本梨果中含量最高的7種揮發性成分(表2)發現，新梨7號與父本早酥中有6種揮發性成分相同，較母本庫爾勒香梨減少了2種萜烯類、1種脂肪酸類和1種烷烴類物質。

4種梨果含量最高的揮發性成分均為己醛和(E)-2-己烯醛，其在新梨7號中均顯著高于父本早酥梨，偏向于高值親本。而d-檸檬烯的含量偏向于低值的父本早酥。除此之外，新梨7號中的(E,E)-2,4-己二烯、(Z)-1-乙氧基-4-甲基-2-戊烯和(E)-4-氧代己-2-烯醛的含量顯著高于其雙親，而α-法呢烯顯著低于雙親。

同組不同小寫字母表示經鄧肯式新復極差檢驗，差異達顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters in the same group indicate that the difference has reached a significant level through Duncan’s new multiple range test (P<0.05).

圖2 新梨7號及其親本揮發性物質相對含量Fig.2 Relative content of volatile compounds in ‘Xinli No. 7’ and its parents

表2 新梨7號及其親本主要揮發性物質含量對比(前7種) Table 2 Comparison of the concentrations of the main volatile compounds in ‘Xinli No. 7’ and its parents (top 7 compounds) μg/kg

續表2 Continued Table 2

2.5 兩地新梨7號揮發性物質的對比

如表3所示，新疆和河北采集的新梨7號相比，前者樣品中大部分揮發性物質含量顯著高于后者，包括萜烯類、芳烴、醇類和烷烴。大部分不同種類的揮發性物質所包含的物質數相近，僅烷烴類物質有差異，河北樣品較新疆樣品減少6種物質(表1)。

兩地的大部分揮發性物質含量介于親本之間，且新疆樣品中的萜烯類、烷烴和芳烴類物質總量顯著高于河北樣品。

表3 兩地新梨7號揮發性物質對比 Table 3 Comparison of volatile compounds between ‘Xinli No. 7’ in two places μg/kg

3 討 論

3.1 雜交品種新梨7號揮發性成分

種間雜交的梨果，品種較新，市場前景較好。張文君等[11]研究了5種雜交梨果及其親本的揮發性成分，通過聚類分析發現，受檢梨果主要分為2組，與其雜交親本的親緣關系基本一致。本研究中，雜交品種新梨7號的主要揮發性成分與親本相似。新梨7號較父母本增加了2種揮發性物質，分別具有青香味和果香(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。較母本減少了42種揮發性物質，總含量減少了約51%，損失了多種具有油脂味的脂肪酸和具有花香味的萜烯類物質；較父本減少了8種揮發性成分，包括己酸、順式芳樟醇氧化物、L-樟腦、β-環檸檬醛、對苯醌、香葉醇、1-十二烷醇和4,6-二甲基-十二烷，分別具有甜味、樟腦味、薄荷味、中藥味、花香和刺激性異味。可以推測其香氣特性較父母本都發生了較大改變，與實際上其香氣濃郁度遠低于庫爾勒香梨的情況相符。但是，揮發性成分對果實香氣的影響主要取決于風味閾值[16]，增加或減少的揮發性成分是否會影響果實風味，有待進一步開展揮發性成分的呈香閾值分析并設計感官評價實驗來進行驗證。

需要明確的是，本研究所采用的新梨7號只是其父母本雜交后代的單株，其他單株在育種過程中因經濟性狀較差、維護成本高而丟棄。因此，無法總結出揮發性物質代謝的遺傳規律，對呈香相關物質的關鍵基因挖掘及香氣品質形成機制的研究而言，尚需另尋他法。

3.2 不同產地對新梨7號揮發性成分的影響

即便是同一品種，產地不同則會產出品質不同的果實，甚至會有很大差異[17]。在果實風味品質方面，變化較大的有可溶性固形物、果實硬度[18]和揮發性成分等。李躍紅等[19]對7個不同產區刺梨的果實品質進行檢測后發現，果實的營養品質維生素C含量和非必需微量元素具有較大差異。

本研究收集、分析了相隔較遠的2個地點新梨7號的樣品，可以大體比較不同環境對揮發性物質的影響。結果表明，兩地揮發性物質種類相似，但新疆地區的新梨7號果皮中的萜烯類、烷烴和芳烴類物質總量更高(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。由此可知，新疆地區種植的新梨7號揮發性成分表現更優。這可能與新疆的氣候、土壤和水源等因素有關。魏樹偉等[20]采用頂空進樣對采自山東省的新梨7號果實揮發性物質進行測定，同樣鑒定到較高比例的己醛、(E)-2-己烯醛、1-己醇等物質，但總物質含量較低，僅為746.61 μg/kg，且僅鑒定到4種萜烯類物質，這與其檢測的樣品組織和揮發性物質的提取方式有關。同時，作為同一種基因型，新疆樣品較父母本增加了(E)-2-辛烯醛、1-十二烯、苯甲酸和柏木腦；河北樣品中增加了(E)-2-辛烯醛、苯甲酸、2-庚酮、2-癸酮和1,2,4,5-四甲基-苯。與父母本相比，兩地新梨7號中有46種揮發性物質變化相似，只有8種物質變化有所差異，包括苯乙醛、異佛爾酮、α-法呢烯、1,2-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-環己醇、2,6,10-三甲基-十四烷、2,6,11,15-四甲基十六烷和丁酸己酯。這8種揮發性物質中有7種物質含量在父母本和新梨7號中均存在且含量較低，只有α-法呢烯(果香味)僅在河北新梨7號中存在，而新疆新梨7號中未檢測到該物質，同時其在庫爾勒香梨中含量很高。因此，環境對新梨7號的揮發性物質種類和含量都有影響，進而影響其香氣品質。