昆明地區引種荷花遺傳多樣性分析

趙琳，林森，趙琬玥，胡慧貞，陳龍清

西南林業大學園林園藝學院/國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心/云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心,昆明 650224

荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)的多年水生草本植物，是中國十大傳統名花中唯一的水生花卉，也是重要的切花植物[1]，能有效吸收水體中的氮和磷，凈化水質[2]。荷花已有2 500多年的栽培歷史，正式文獻記載的名稱全球已達2 080個[3]，根據用途劃分為花蓮、籽蓮及藕蓮，是集觀賞、食用和藥用價值于一身的重要的經濟植物。

物種適生性及遺傳多樣性研究有助于探究物種對環境變化的響應，采取人為手段幫助物種適應環境變化，對于保護和利用遺傳資源以及改良植物性狀具有重要意義[4]。荷花為異花授粉植物，高度雜合，遺傳變異多樣，可供選擇的親本數量龐大，通過分子標記技術手段能高效且精確地反映個體分子水平上的遺傳差異優勢，目前常用的分子標記有InDel、SSR、SRAP、Scot等。其中InDel和SSR作為共顯性標記廣泛分布于基因組中，數量眾多、突變率高、雜合程度高、多態性含量較高，在植物遺傳多樣性分析中應用廣泛。Indel標記是不同個體基因組同一位點序列核苷酸片段的插入和缺失，其檢出效率較高[5]。SSR標記為簡單重復序列，按其來源可分為基因組SSR和EST-SSR，廣布于整個基因組中，在荷花的進化及多樣性分析中得到廣泛應用[6]。此外，SSR標記及SNP標記在鑒別品種中具有較高的靈敏度，被國際植物品種權保護聯盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)確定為構建植物品種DNA數據庫的首選標記[7]。

2013年中國古代蓮全基因組測序完成[8]；2018年 “Chinese Tai-Zi”染色體水平上的基因組組裝完成[9]；這2個基因組測序的完成為荷花功能組學研究和新基因的挖掘提供了豐富的遺傳信息，為解析不同生物學性狀提供了基礎。Hu等[10]對58個荷花種質資源進行遺傳多樣性分析，藕蓮和籽蓮分別聚為不同類群，花蓮在2個類群中均有分布。Yang等[11]利用36對SSR標記對來自不同地區的11個居群的83份荷花資源進行遺傳多樣性和群體結構分析，發現泰國蓮與中國蓮居群之間的親緣關系比美洲黃蓮近。Yang等[12]結合分子標記對210份荷花種質資源進行連續2 a的表型觀測，對荷花重要觀賞性狀遺傳定位進行了研究。AN等[13]對18個省的94份藕蓮進行了遺傳多樣性分析，發現西南地區和華東地區的藕蓮品種具有更高的遺傳多樣性。Zheng等[14]通過EST-SSR標記構建包括荷花在內的3類水生植物指紋圖譜，為快速鑒定后代種子是否純合提供了便利。

云南地區高原湖泊眾多，地理和氣候環境多樣，植物多樣性豐富。普者黑、鶴慶等地素有栽培荷花的傳統，近期有研究指出，云南熱帶地區可能是野生荷花及重瓣型荷花的原產地[15]。云南鄉土荷花品種 ‘普者黑紅荷’‘普者黑白荷’‘小灑錦’‘宜良千瓣’ 等皆具有較高的食用價值及觀賞價值[16]，但目前云南地區栽種的荷花多為外地引進品種，品種混雜，缺乏系統研究。為明確昆明地區引種栽培的荷花種質資源的遺傳背景，更好地發揮該地區的生態環境優勢，本研究利用InDel、EST-SSR和SSR標記對94份在昆明地區收集的引種荷花種質進行遺傳多樣性分析，充分了解引種栽培荷花遺傳多樣性、明確遺傳背景，以期為云南地區推廣荷花栽培提供參考依據并為荷花育種提供優良親本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

94份荷花種質原產于重慶大足、廣西貴港、湖北武漢及四川遂寧等地，其中52份引種后種植于西南林業大學荷花種質資源圃，其余試驗樣品在云南昆明、曲靖、西雙版納地區采集所得，其中有30份為實生選育品種。品種信息詳見表1。

1.2 材料種植及管理

2018年4月上旬，選取頂芽保存完好、藕身具膨大的藕節2節及以上的種藕，種植于口徑 65 cm×高 70 cm 的黑色塑料缸。每缸種植2支，每一品種種植5缸，采用“藏頭露尾”的方式栽植，根據植株生長狀況適時進行科學管理。

1.3 DNA提取及標記擴增

選取無病蟲害剛出水面的卷葉，采用天根多糖多酚專用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-02)提取DNA；經瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，Nanodrop 2000測各樣本質量濃度并記錄，將各樣本稀釋至50 ng/μL，于 -20 ℃保存備用。

50對InDel引物為課題組自主開發，50對EST-SSR和50對SSR引物來源于已發表的文獻[6,11,17-18]，均由上海生工生物股份有限公司合成。隨機選擇5份供試材料DNA進行擴增，每個標記篩選出各20對多態性好、條帶清晰的引物用于94份種質荷花的遺傳多樣性研究。采用6% 的聚丙烯酰胺凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳、銀染、顯影、人工讀帶。

1.4 數據處理

利用Excel對分子標記擴增條帶進行統計整理。利用POPGEN 32及PIC_CALC進行遺傳多樣性指標分析，利用Excel 2007及NTSYS-pc 2.10e進行遺傳相似系數分析及Mantel檢測。使用MEGA-X采用UPGMA法進行聚類，iTOL在線工具進行美化。利用Structure 2.3.4進行群體結構分析，使用Structure Harvest在線工具計算最佳K值，確定群體數量。

2 結果與分析

2.1 InDel、EST-SSR、SSR遺傳多樣性分析

分別選取InDel、SSR、EST-SSR各50對引物進行擴增，篩選出InDel、SSR和EST-SSR各20對能擴增出豐富、穩定、清晰條帶的標記對引種的94份荷花種質進行分析，發現篩選出的標記能較好地揭示94份荷花材料多樣性及遺傳差異(表2)。3種分子標記共擴增204條條帶，總共檢測到233個等位基因。每種標記都表現出較高多樣性水平，平均Shannon指數≥0.85，基因多樣性指數≥0.52，多態性信息含量≥0.44，其中SSR標記在94份荷花種質中表現出更高的多態性水平。

2.2 InDel、EST-SSR和SSR標記相關性檢測

對3種標記進行Mantel檢測，相關性分析結果(表3)顯示，InDel、EST-SSR和SSR三者間相關性除EST-SSR和SSR≥0.529 0，其他均小于0.5，說明3種標記間的相關性較差，但3種標記組合與InDel、EST-SSR和SSR遺傳相似系數矩陣相關性系數均大于0.789 4，呈高度正相關，表明可以采用3種標記組合進行遺傳多樣性分析。

表1 供試種質及其來源 Table 1 Ninety-four Lotus accessions used in this study and their origins

續表1 Continued Table 1

注:1)帶“?”表示該材料信息不詳; 2)‘優良株系X-X’為自主培育的新品種; ‘秋日紅花’ ‘秋星’ ‘秋艷’‘秋陽’‘秋玉’為秋荷品種,為中國蓮與泰國蓮雜交的后代。Note:1) Materials with ‘ ? ’mean unknown information; 2)‘ Youliang Zhuxi ’is new varietiy cultivated independently; ‘ Qiuri Honghua ’ ‘ Qiuri Xing ’ ‘ Qiu Yan ’ ‘ Qiu Yang ’ ‘ Qiu Yu ’ are autumn lotus varieties,the off-springs of crosses between Chinese lotus and Thai lotus.

表2 InDel、EST-SSR、SSR引物多態性分析 Table 2 The polymorphism analysis of InDel，EST-SSR and SSR

表3 InDel、EST-SSR、SSR標記遺傳相似系數相關系數 Table 3 Correlation coefficients of InDel,EST-SSR,SSR genetic similarity coefficients

2.3 基于InDel、EST-SSR和SSR的聚類分析

聚類分析將94份種質資源劃分為5大類(圖1)。結合種源地信息、形態特征和聚類結果綜合分析，結果表明：可以將類群 Ⅰ 細分為6個亞群。類群 Ⅰ-Ⅰ 有 33份材料，種源地為重慶及武漢的材料居多，除‘金鳳凰’‘如意觀音’為中美雜交蓮，31份為中國蓮，4份為實生苗選育品種，均為單瓣品種，其余29份荷花材料為重瓣荷花；除‘金鳳凰’為黃色，‘水中月’為白色以及‘大灑錦’為灑錦色系以外，其余均為紫堇色或淡紫堇色系。類群 Ⅰ-Ⅱ 有8份材料，僅‘玉鸝’為中美雜交蓮，其余均為湖北武漢地區的中國蓮，除‘艷陽天’外均表現為中小株型重瓣荷花，類群 Ⅰ-Ⅲ 有7份材料，僅‘錦紅袍’為中美雜交蓮，其余均為中國蓮品種，2個為秋荷品種，3個品種為太空育種品種，‘千瓣蓮’被劃分在此類群內，花色多為紫堇色。類群 Ⅰ-Ⅳ 有17份材料，均為中國蓮品種，無明顯的種源地劃分；花色均為紫堇色或淡紫堇色系，大株型品種較多，3份秋荷品種聚類到一起，單瓣大株型籽蓮均在此類群內，遺傳距離較近。Ⅰ-Ⅴ 僅‘新披針紅’一份材料，引自江蘇南京，為中小型重瓣荷花。Ⅰ-Ⅵ 類群有19份材料，有4份為美洲蓮品種，以湖北武漢地區引種品種較多，多為當年蓮子播種的中小株型荷花。

帶▲為實生苗栽培品種 The cultivars with ▲ are indicated seeding culticars.圖1 94份荷花種質資源聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 94 lotus

類群 Ⅱ，‘SN’獨聚為一支，該品種來自日本，與其他荷花品種地理距離較遠。

類群 Ⅲ，‘粉紅凌霄’獨聚為一支，為熱帶蓮品種。

類群 Ⅳ 有6個材料，除‘紅桃子’無法確認其種源外，其中5個均為中美雜交蓮，花色除‘媚態觀音’及‘紅桃子’為復色品種外，其余以黃色和白色為主。

類群Ⅴ，‘美洲黃蓮’獨聚為一支。

2.4 群體結構分析

為了明確不同種質間的群體結構關系及遺傳背景差異，對94份材料的群體遺傳結構進行分析，從圖2可以看出，94份荷花材料在K=5時，ΔK出現峰值，說明在此群體中有5種主要的基因組結構成分。

圖2 ΔK隨K變化的折線圖Fig.2 ΔK values changing with K value

群體結構分析的分組結果(圖3)顯示，根據顏色的不同可將94份荷花的主要遺傳組分劃分為5種；根據遺傳組分的相似性可以將94份種質聚類成5個亞群，各亞群所包含的種質材料與聚類分析的結果有相似之處。

遺傳組分的分組結果顯示群體R與聚類分析中的 Ⅰ-Ⅳ 種質資源較一致，除‘媚態觀音’外，其余均為中國蓮，種系不明的‘紅桃子’可能為中美雜交蓮；大部分為子蓮及實生苗選育品種。群體G中與聚類分析中的類群 Ⅰ-Ⅰ 中的大部分種質一致，大都為中國蓮品種，其中僅1份為黃色系中美雜交蓮‘金鳳凰’，但其遺傳組分與美洲黃蓮相似度較低。群體B中除‘水中月’為白色外，均為堇紫色品種。‘錦紅袍’‘陶然一笑’‘如意觀音’與美洲蓮遺傳組分的相似度很低，所以聚類結果中類群 Ⅰ-Ⅰ 及類群 Ⅰ-Ⅲ 均為中國蓮遺傳組分占比高的種質資源。群體Y主要分布在類群 Ⅳ、Ⅴ 中，均為美洲蓮及中美雜交蓮。群體P與類群 Ⅰ-Ⅴ 中的種質較一致，以武漢地區中國蓮為主，大部分為中小型荷花品種實生苗；其中‘玉鸝’與美洲蓮相似的組分很低，所以與中國蓮聚類在同一個組中；來自日本的‘SN’也在此群體內，同一品種的不同實生苗遺傳組分也有所差異，且其遺傳組分組成較復雜。

圖中數字為種質材料編號。The accession numbers are indicated in the figure.圖3 群體結構Q圖Fig.3 Q-plot of the population structure

3 討 論

3.1 組合分子標記對遺傳多樣性的檢出率高

本研究中的94份荷花種質來源廣泛，遺傳背景復雜，觀賞性狀及農藝性狀豐富。不同的分子標記其來源不同，所揭示的基因位點的遺傳信息有所差異，可以為遺傳多樣性研究及種質資源分類提供更豐富的遺傳信息，本研究通過Mantel檢測發現組合標記與單個分子標記的r值均大于0.75，采用組合分子標記發現供試群體具有豐富的遺傳多樣性。Hu等[10]利用AFLP和SSR標記進行遺傳多樣性分析，發現AFLP、SSR聯合分析的遺傳相似系數分別與AFLP和SSR標記高度匹配，使用聯合標記可以更好地進行聚類。Yang等[19]使用SSR、SRAP對43份荷花材料進行基因分型，SSR-SRAP聯合分析分別與SSR、SRAP高度相關。本研究的群體結構分析顯示，同一品種的實生苗在遺傳組分上存在一定差異，說明聯合標記檢出率更高，在一定程度上能揭示較多的遺傳信息。

3.2 形態和分子標記相結合更利于對引種荷花的評價

結合3種分子標記的結果進行聚類分析，發現荷花種質在分子水平上與形態水平上對資源的分類并不完全一致，但具有一定的關聯性，袁王俊等[20]在菊花的遺傳多樣性分析中也發現，傳統的分類方法不能完全反映菊花的親緣關系，說明分子水平上揭示的遺傳信息差異不一定能在形態上表現出來；在關聯分析的研究中發現，分子標記位點間的相互連鎖會導致同一個分子標記位點同時影響多個相互關聯的表型性狀[21]。傳統的形態學特征與荷花的經濟價值直接相關，將形態學標記與分子標記結合分析對育種實踐具有重要的指導意義。聚類的群體與種質資源的種源地沒有明顯的關聯，這與尹靜靜等[22]和李青竹等[23]對種藕的研究結果類似。Yeshitila等[24]利用9對SSR標記對來自不同自然地理分布的15個群體共計216個熱帶蓮樣本進行遺傳多樣性分析，發現遺傳距離與地理距離存在正相關關系，但是Islam等[25]利用12對SSR引物對326個美洲蓮的遺傳多樣性分析，發現遺傳距離與地理距離無顯著相關性。在本研究中，‘SN’‘粉紅凌霄’‘美洲黃蓮’等種源地與中國蓮種質資源明顯分隔的品種，無論是在聚類還是群體結構分析中與中國蓮品種均有差異，而群體內來自中國各地區的種質資源無明顯劃分，可能是由于引種的品種多為近期人工雜交選育，各地種質資源交流頻繁導致基因交流頻繁，基因組分較為復雜。籽蓮品種均聚類在同一個群體或類群內，大部分的研究表明藕蓮、籽蓮在分子水平上有較大的差異，它們復雜的遺傳關系可能是由于長期人工選擇和無性繁殖逐漸形成的遺傳差異[19,26]。本研究中花蓮觀賞性狀豐富，且部分品種與籽蓮遺傳分化明顯，可選擇優良品種與結實較多的籽蓮進行雜交，選育新品種。

在聚類及群體結構分析中發現，部分有記載種系來源的荷花品種與聚類結果有差異，可能是由于標記數量較少導致，同時聚類及遺傳結構分析也能幫助重新注釋品種的背景，為后續的研究提供科學的指導。

聚類結果以及群體結構分析皆顯示，美洲蓮被獨聚為一支，與亞洲蓮遺傳距離較遠，與前人研究結果一致[15]。中美雜交蓮在聚類的過程中沒有完全聚在一起，這可能是由于不同品種的中美雜交蓮遺傳組分構成不同，通過群體結構分析也可看出，部分中美雜交蓮遺傳組分與美洲蓮相似度極低，與中國蓮相似度更高。秋荷品種也并未完全聚類到一起，除秋玉外，其余品種遺傳組分類似，與種源地為泰國的‘粉紅凌霄’遺傳組分部分相似。

綜上，InDel、EST-SSR和SSR 3種分子標記組合對荷花多樣性研究有較高的檢出率，94份荷花品種遺傳多樣性高，亞洲蓮及美洲蓮有明顯遺傳分化，不同品種的中美雜交蓮或秋荷在遺傳組分存在差異，研究結果可為后續的優良品種選育及選配適合的雜交組合提供種質資源及技術支撐。