溫度對克氏原螯蝦胚胎和幼體發育的影響

劉永鑫，張殿福，陶忠虎，付峰，顧澤茂

1.華中農業大學水產學院/華中農業大學雙水雙綠研究院/湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心/教育部長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展工程研究中心，武漢 430070； 2.湖北省潛江市農業事業發展中心，潛江 433100； 3.湖北省潛江市農業農村局，潛江 433100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，是一種重要的淡水經濟蝦類，具有掘洞、爬行等生物學習性，能有效利用稻田空間、稻稈和水資源進行繁育與生長，與水稻構成了和諧的生態系統，形成“雙水雙綠”種養體系[1]。因此，興起于21世紀初的“蝦稻共作”模式，近年來在我國發展迅速，2019年全國克氏原螯蝦稻田種養面積達110.59萬 hm2，產量177.25萬 t[2]。然而，克氏原螯蝦產業在快速發展的過程中，苗種供應成為最大難題。早期克氏原螯蝦的苗種主要為捕撈湖泊和溝渠的野生苗，后期主要通過稻田投放種蝦或留種育苗，這種稻田育苗方式難以滿足大面積擴張過程中的苗種需求，很多地方出現了“一苗難求”的現象[3]。

溫度是影響蝦類生長發育的重要環境因子之一，確定克氏原螯蝦苗種孵化的適宜溫度，是人工繁育所必需掌握的生物學基礎。關于溫度對克氏原螯蝦繁殖與發育的影響，已有一些報道[4-7]，但對胚胎和幼體發育的適宜溫度范圍研究結果不一致，同時，缺乏不同溫度下的成活率數據。筆者比較了不同溫度下克氏原螯蝦胚胎和幼體的發育速率和成活率，系統觀察了克氏原螯蝦胚胎和幼體發育時期的形態變化，以期補充克氏原螯蝦的發育生物學數據，為稻田繁育蝦苗提供技術支撐，并在實踐操作中指導養殖戶通過調節水溫提早繁育蝦苗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗設計

試驗用克氏原螯蝦親蝦采自監利縣雙水雙綠示范基地，體質量(25.02±1.05) g。在室內進行人工交配，每天觀察親蝦繁殖情況，發現抱卵蝦及時取出。試驗用水為曝氣24 h的自來水，溶氧量保持在(8.0±0.5) mg/L，氨氮水平(0.02±0.01) mg/L，pH 8.0～8.5。試驗容器為60 cm×40 cm×20 cm的塑料水槽，加熱棒控制水溫。

設置19、22、25、28 ℃ 4個溫度處理組，溫差不超過±0.5 ℃。每個溫度梯度放12尾抱卵蝦，其中6尾用于胚胎和幼體發育成活率的計算，6尾用于發育過程的跟蹤觀察[8]。水槽中始終保持20 L試驗用水。增氧泵持續向水槽充氣，每2 d換1次水，每次換水體的1/2，換同等水溫的曝氣水。

1.2 樣本采集與觀察

采集抱卵蝦的受精卵，根據胚胎發育情況，抱卵初期每2 h取樣觀察1次；胚胎發育到囊胚期之后每4 h取樣觀察1次；胚胎進入原腸胚和器官發生期后，每12 h取樣觀察1次。每次取表層卵5～8粒，在體視顯微鏡(Leica M205 FA)下觀察拍照，記錄各期發育特征。每天早、晚各檢查1次，清除死卵。幼體全部孵出后，統計胚胎的孵化時間和孵化率，孵化時間為半數幼體出膜的時間。

幼蝦出膜后每12 h觀察1次，直至卵黃囊消失。每次每個重復隨機取樣3～5尾，在體視顯微鏡(Olympus SZX16)下觀察拍照，記錄幼體形態特征。每天早、晚各檢查1次，清除死蝦，幼蝦死亡以心臟停止跳動為準。統計幼體階段的發育時間和成活率，發育時間為半數幼體到達該期的時間。

1.3 數據統計分析與計算

胚胎孵化率(RH,%)、幼體從孵化到Ⅳ期的成活率(RⅣ,%)、生物學零度(C, ℃)及有效積溫(K,℃·h)采用以下公式計算：

RH=(NM/NE) ×100%

RⅣ=(NⅣ/N0) ×100%

K=t(T-C)

式中，NE為親本懷卵量；NM為幼體孵化總量；NⅣ為Ⅳ期幼體數量；N0為試驗開始時幼體總數；t為發育時間；v為發育速率(1/N)；T為平均水溫，℃；C為發育的生物學零度，℃[9]。

試驗數據均表示為平均值±標準差(Mean±SD)，利用SPSS 26.0對數據進行單因素方差分析和多重比較，以P<0.05表示差異顯著。數據之間的關系采用統計作圖軟件GraphPad 8.0進行曲線擬合分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對胚胎發育的影響

1)胚胎發育分期。參照堵南山[10]對螯蝦類胚胎發育的分期，將克氏原螯蝦胚胎發育過程分為Ⅰ～Ⅵ期6個階段(圖1)。各期主要特征如下：Ⅰ期(受精卵期)：胚胎呈球形，不透明，質膜緊貼，卵質表面沒有隆起(圖1-1)；Ⅱ期(卵裂期)：質膜分離，顏色略有加深(圖1-2)；Ⅲ期(囊胚期)：卵黃表面分裂，形成放射狀排列的初級卵黃錐體，卵中央部分不分裂，即為中央質(圖1-3、1-4)；Ⅳ期(原腸胚和器官發生期)：細胞開始凹陷，胚孔形成，2對視葉原基出現(圖1-5、1-6、1-7)；Ⅴ期(卵內無節幼體期)：2對觸角原基與3對顎足原基相繼形成，開始出現淡黃色的囊狀心臟(圖1-8、1-9)；Ⅵ期(卵內蚤狀幼體期)：胸肢和腹肢原基陸續出現，復眼形成，心跳頻率增加且節律趨于穩定(圖1-10、1-11、1-12)。

2)溫度對胚胎孵化率的影響。在試驗溫度(19～28 ℃)范圍內，克氏原螯蝦胚胎均能正常孵化。溫度對孵化率有顯著影響(P<0.05，表1)，隨著溫度的升高，孵化率呈現“先升后降”的趨勢，水溫22 ℃時孵化率最高，為91.03%±2.97%；水溫28 ℃時孵化率最低，為40.53%±4.97%，且顯著低于其他3組(P<0.05)。溫度(T)與孵化率(RH)的關系可以用二項方程式較好地擬合：RH=-1.515T2+ 66.83T- 641.5，R2=0.935 0(P<0.01，圖2)，根據曲線擬合方程計算得出22.06 ℃時孵化率最高。

3)溫度對胚胎發育持續時間的影響。由表2可知，溫度對克氏原螯蝦胚胎各階段發育時間均有顯著影響(P<0.05)，同一溫度不同胚胎階段歷時也不相同。其中，原腸胚和器官發生期歷時最長，為(111.33±3.01)～(205.33±3.27) h，占32.20%～33.01%；卵內蚤狀幼體期是耗時第二長的階段，占29.13%～29.27%；卵內無節幼體時期耗時略低于前兩者，占22.70%～25.24%，其他幾個階段耗時都比較少，總和不超過胚胎發育總時間的15%。整體來看，在19～28 ℃內，胚胎發育速率隨溫度的升高而加快，水溫19 ℃時的孵化時間最長，為(622.67±6.02) h；水溫28 ℃時，孵化時間最短，為(349.67±4.63) h。溫度(T)與孵化時間(D)的關系可以用二項方程式較好地擬合：D=0.1709T2-9.254T+139.9，R2=0.984 9(P<0.01，圖3)，根據曲線擬合方程計算得出，27.07 ℃時胚胎孵化速度最快。

1.受精卵； 2. 卵裂期； 3～4.囊胚期； 5～7. 原腸胚和器官發生期； 8～9. 卵內無節幼體期； 10～12. 卵內蚤狀幼體期。 CM：中央質； OLP：視葉原基； D：胚孔；AP：觸角原基； H：心臟； OL：視葉； CE：復眼。 標尺：1 mm。1. Zygote; 2. Cleavage stage; 3-4. Blastula stage; 5-7. Gastrula and organogenesis stage; 8-9. Nauplius stage; 10-12. Zoea stage. CM:Central mass; OLP:Optic-lobe primordium; D:Gastrula with dent; AP:Antenna-primordium; H:Heart; OL:Optic lobe; CE:Compound eyes. Scalebars are 1 mm.

表1 不同溫度下克氏原螯蝦孵化率和幼體成活率 Table 1 Hatching rate and larval survival rate of Procambarus clarkii at different temperature

圖2 克氏原螯蝦孵化率和水溫的關系Fig.2 The relationship between hatching rate and water temperature

圖3 克氏原螯蝦孵化時間和水溫的關系Fig.3 The relationship between hatchingtime and water temperature

4)胚胎發育的生物學零度及溫度與有效積溫的關系。采用Sanderson-Pearis公式，計算得出克氏原螯蝦胚胎發育的生物學零度為7.32 ℃，即水溫低于7.32 ℃，胚胎停止發育。將C=7.32代入公式K=t(T-C)中，計算不同溫度下胚胎發育的有效積溫，由表2可知，溫度對其有顯著影響(P<0.05)，在試驗溫度(19～28 ℃)范圍內，隨溫度的升高，胚胎發育的有效積溫“先降后升”，水溫22 ℃時所需要的有效積溫最低，為(6 494.58±150.21) ℃·h。

表2 不同溫度下克氏原螯蝦胚胎各階段的發育時間 Table 2 Development time of embryo stages of Procambarus clarkii at different temperatures

2.2 溫度對幼體發育的影響

1)幼體發育分期。根據其外部形態特征，將克氏原螯蝦幼體發育階段分為4個時期(圖4)。各期主要特征如下：Ⅰ期幼體，即剛破膜的幼體，頭胸部充滿卵黃，無眼柄；胸肢5對，不具攝食能力；腹肢4對，較成體少1對；尾部不能打開；附肢均無剛毛(圖4A)。Ⅰ期幼體經1次蛻殼后為Ⅱ期幼體，該時期眼柄出現，頭胸部卵黃囊呈“U”型，隨發育進程會逐漸縮小呈“V”型；胸肢開始具備攝食能力；附肢邊緣開始長出剛毛(圖4B)。幼體第2次蛻殼后進入Ⅲ期幼體發育階段，頭胸部卵黃囊呈“V”型，隨發育進程會逐漸消失；第一胸足螯鉗能自由張合，可有效捕食和抵御小型生物；第1、2觸角環節數增加，尾部可自由張合(圖4C)。幼體第3次蛻殼后進入Ⅳ期幼體發育階段，該時期眼柄發育已基本成形，頭胸部卵黃囊消失；第一腹肢出現，腹肢變為5對，布滿剛毛；頭胸甲殼顏色變深，肉眼已看不到腹內消化道(圖4D)。此時幼體已基本完成了外部結構的發育，之后便開始進入仔蝦發育階段。

A.Ⅰ期幼體； B.Ⅱ期幼體； C.Ⅲ期幼體； D.Ⅳ期幼體. 標尺：1 mm。 A.Larval stageⅠ; B.Larval stage Ⅱ; C.Larval stage Ⅲ; D.Larval stage Ⅳ. Scalebars are 1 mm.

2)溫度對幼體成活率的影響。在試驗溫度(19～28 ℃)范圍內，克氏原螯蝦幼體成活率均可達80%以上。由圖5可知，幼體成活率隨溫度的升高呈現“先升后降”的趨勢。水溫22 ℃時，幼體成活率最高，為94.37%±1.60%；水溫28 ℃時，幼體成活率最低，為82.67%±1.51%，且各溫度組幼體成活率差異顯著(P<0.05，表1)。溫度(T)與幼體成活率(RⅣ)的關系可以用二項方程式較好地擬合：RⅣ=-0.4111T2+ 18.73T-119.9，R2=0.838 4(P<0.01，圖5)，根據曲線擬合方程計算得出22.78 ℃時幼體成活率最高。

圖5 克氏原螯蝦幼體成活率和水溫的關系Fig.5 The relationship between larval survivalrate and water temperature

3)溫度對幼體發育持續時間的影響。由表3可知，溫度對克氏原螯蝦幼體各階段發育時間均有顯著影響(P<0.05)，同一溫度不同幼體階段歷時也不相同。其中，Ⅲ期幼體發育持續時間最長，為(76.00±6.20)～(120.00±6.20) h，占38.68%～39.84%；Ⅱ期幼體發育次之，占31.96%～33.02%；Ⅰ期幼體發育持續時間最短，占27.63%～29.25%。整體來看，在試驗溫度(19～28 ℃)范圍內，溫度對幼體發育速度有顯著影響(P<0.05)。水溫19 ℃時，幼體發育時間最長，為(304.00±10.73) h；水溫28 ℃時，幼體發育時間最短，為(194.00±9.03) h。溫度(T)與發育時間(D)的關系可以用二項方程式較好地擬合：D=0.03472T2- 2.151T+ 41.05，R2=0.966 2(P<0.01，圖6)，根據曲線擬合方程計算得出，30.98 ℃時幼體發育最快。

4)幼體發育的生物學零度及溫度與有效積溫的關系。采用Sanderson-Pearis公式，計算得出克氏原螯蝦幼體發育的生物學零度為3.29 ℃，即水溫低于3.29 ℃，幼體停止發育。將C=3.29代入公式K=t(T-C)中，計算不同溫度對應的幼體發育有效積溫，由表3可知，在試驗溫度范圍內，溫度對幼體發育有效積溫無顯著影響(P>0.05)。

表3 不同溫度下克氏原螯蝦幼體各階段的發育時間 Table 3 Development time of larvae stages of Procambarus clarkii at different temperatures

圖6 克氏原螯蝦幼體發育時間和水溫的關系Fig.6 The relationship between larval developmenttime and water temperature

3 討 論

3.1 溫度對克氏原螯蝦胚胎發育的影響

在胚胎發育過程中，卵黃物質為主要營養來源，升溫可增強卵黃蛋白降解酶的活性，繼而促進相關代謝活動，加快胚胎發育速度[11-12]。韓曉磊等[6]的研究發現，30 ℃時克氏原螯蝦胚胎(抱卵)發育僅需15 d；在Jin等[7]的溫度梯度試驗中，克氏原螯蝦胚胎(抱卵)孵化用時隨溫度升高逐漸縮短，水溫25 ℃下僅需21 d；而呂佳等[4]的研究表明，在12～39 ℃條件下，孵化時間隨溫度升高“先減小后增加”，33 ℃時用時最短，為29 d。本研究中，在19～28 ℃溫度范圍內，孵化時間隨溫度的升高而縮短，水溫19 ℃時的孵化時間最長，水溫28 ℃時孵化時間最短。這與韓曉磊等[6]和Jin等[7]的研究結果較一致；但與呂佳等[4]的研究結果相比，本研究中相同溫度下的孵化速度較快。分析其原因可能與抱卵的方式有很大關系，即抱卵蝦胚胎的孵化速度和孵化率遠高于非抱卵胚胎[13]。

不同蝦類種群對溫度的耐受也不同，當水溫超過溫度耐受范圍時，胚胎發育異常甚至死亡[14-15]。日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)胚胎在36 ℃以上溫度條件下不能正常孵化[16]；脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)胚胎在溫度超過30 ℃時不能正常發育[8]；紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)受精卵在水溫低于22 ℃或超過35 ℃時，均不能正常孵化[17]。本研究中，在試驗溫度(19～ 28 ℃)范圍內，克氏原螯蝦胚胎均能正常孵化，孵化率隨著溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢，在水溫22 ℃時達到最高，但在28 ℃時胚胎孵化率僅為40.53%，顯著低于其他溫度組。這可能是因為胚胎內某些卵黃降解酶的活性在高溫時受到抑制，從而導致了胚胎出現畸形，甚至死亡[18-19]，也可能是由于高溫使克氏原螯蝦抱卵剛毛黏附性降低，卵散落于水體底部后因缺氧而死亡，具體原因仍需進一步深入研究。

3.2 溫度對克氏原螯蝦幼體發育的影響

溫度對克氏原螯蝦幼體的生長和存活有明顯的影響[5-6]。本試驗在水溫19～28 ℃條件下，幼體發育速度隨溫度升高而加快，這與李銘等[5]在一定溫度范圍內高溫可明顯促進克氏原螯蝦幼體發育的結論一致，也與研究脊尾白蝦[20]、中國對蝦(Penaeuschinensis)[21]以及凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[22]等的結果一致。但當環境溫度超過了動物自身的調節能力時，會導致生長受限，死亡率升高[23-24]。脊尾白蝦在36 ℃高溫時幼體無法正常變態為仔蝦[20]；日本沼蝦在31 ℃高溫時幼體死亡率高達88%[25]；墨吉明對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)幼蝦在溫度低于14 ℃的水中，停止攝食，24 h后全部死亡[26]。李銘等[5]的研究中克氏原螯蝦在31 ℃條件下，死亡率很高，3～4周后全部死亡。本研究中，在19～28 ℃溫度范圍內，克氏原螯蝦幼體均可正常發育，成活率隨溫度升高“先上升后下降”，水溫22 ℃時成活率最高。與馬盛群等[25]、李銘等[5]的研究結果相比，幼體成活率相對較高，分析其原因可能與蝦自身的體質和母體“熱史”有關。在本研究中，高溫(28 ℃)條件下，幼體成活率顯著降低，這可能是因為高溫加快了新陳代謝速率，自身營養物質的積累難以滿足代謝消耗，從而導致幼體無法完成生長蛻殼，最后死亡[27]。

本試驗中還發現，同一溫度胚胎和幼體時期成活率明顯不同，幼體對溫度的耐受范圍要高于胚胎。這可能與機體自身營養供給有很大關系，Ⅱ～Ⅲ期幼體可開口攝食水體中小型浮游生物，從而為高溫條件下機體較快的新陳代謝提供能量，而胚胎時期的能量消耗只能靠自身卵黃物質提供。綜合各項指標，我們建議克氏原螯蝦人工繁育過程中胚胎和幼體發育的溫度范圍設為22～25 ℃。