小麥麥麩阿拉伯木聚糖的體外降脂作用研究

張修威，袁婷婷，牛猛，張賓佳，賈才華，許燕， 趙思明

華中農業(yè)大學食品科學技術學院，武漢 430070

隨著人們生活水平的不斷提高和日常攝入高脂飲食比例的增加，肥胖人群所占的比例逐漸增大，與其相關疾病的發(fā)病率也在隨之升高[1]。肥胖被普遍認為是心血管疾病、高血脂等病癥的主要誘發(fā)因素[2]。脂肪攝入與吸收量和脂肪酶活性是影響脂質代謝的重要因素。前期研究表明[3]，減少脂肪吸收量與抑制脂肪酶活性是干預和預防肥胖的重要途徑。食物組分通過結合體內膽酸鹽能夠促進血液中膽固醇的代謝，從而起到控制血脂水平的作用；抑制脂肪酶的活性可以減少食物中甘油三酯的水解從而降低膽固醇的產(chǎn)生，達到控制血脂的目的。

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，AX)是一種廣泛存在于谷物中的多糖，是谷物細胞壁的重要組成部分。小麥是我國的主要農作物之一，每年小麥加工所產(chǎn)生的副產(chǎn)品中麥麩占了絕大部分[4]。麥麩中AX的含量可達25%左右[5]。根據(jù)AX溶解性的不同可分為水溶性AX(water-extractable arabinoxylan，WEAX)和水不溶性AX(water-unextractable arabinoxylan，WUAX)。在小麥中，WEAX占AX總量的25%～30%，具有高黏性。剩余的AX為WUAX，具有較高的持水能力[6]。AX作為一種重要的膳食纖維，具有調節(jié)腸道菌群、控制血糖水平、降血脂[7]、調節(jié)代謝、抗氧化活性[8]等生理功能。

已有研究[9-12]表眀，麥麩AX具有調節(jié)血脂代謝的作用，補充AX可以改善餐后血脂水平和降低體內總膽固醇水平、抵消高脂飲食引起的腸道環(huán)境紊亂、預防肥胖癥狀和減輕體質量。目前關于AX調節(jié)血脂代謝的機制尚不明確，對不同類型的AX如WUAX和WEAX降脂活性的研究鮮見報道。本研究以小麥麥麩WUAX和WEAX為研究對象，探究2種AX的膽酸鹽結合力和胰脂肪酶抑制活性，闡釋AX結構對其降脂作用的影響，為植物多糖調節(jié)血脂代謝機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全麥粉，購于河南省大程糧油集團股份有限公司；牛磺膽酸鈉(sodium taurocholate hydrate，STC)、甘氨膽酸鈉鹽(sodium glycocholate hydrate，SGC)、胰脂肪酶(豬)(9001-62-1，30 000 U/g)、堿性蛋白酶(9014-01-1，200 U/mg)和高溫α-淀粉酶(9001-19-8，20 000 U/mL)均購于上海源葉生物科技有限公司；淀粉葡萄糖苷酶(9032-08-0，70 U/mg)購于阿拉丁生化科技股份有限公司；地衣聚糖酶(N/A，5 000 U/mL)購于愛爾蘭Megazyme公司。以上試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4恒溫水浴鍋，RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，BSA124S分析天平，SF-TDL-5A離心機，F(xiàn)D-1-50冷凍干燥機，722N可見-分光光度計，Thermo Multiskan Go全自動酶標儀。

1.3 WEAX和WUAX的提取

1)粗AX提取。將全麥粉過篩(孔徑0.15 mm)得到麥麩，將麥麩在4 ℃下用蒸餾水浸泡1 h，隨后將濕潤的麥麩用蒸餾水洗滌多次，進一步去除殘留的小麥粉。將洗滌后的濕麥麩置于50 ℃烘箱12 h，稱取烘干的麥麩150 g與2.25 L 0.15 mol/L NaOH溶液(包括0.5% H2O2)在80 ℃下反應90 min后離心(4 000 r/min，30 min),將上清液調整至pH值為4.5后同樣條件再次離心。蒸發(fā)濃縮上清液至原體積的1/4左右后使用乙醇沉淀(乙醇最終體積分數(shù)為65%)，離心(4 000 r/min，30 min)后得到上清液。

2)WUAX提取。在上清液中加入堿性蛋白酶以去除蛋白，40 ℃水浴40 min，然后煮沸滅酶，使用透析袋(孔徑0.1 nm)將上清液用去離子水透析72 h，冷凍干燥得到WUAX。

3)WEAX提取。在上清液加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4 ∶ 1，V/V)至所占比例為20%，劇烈振蕩1 h，離心收集水層，重復5～6次。然后將水層冷凍干燥得到粗多糖，將其溶于去離子水，加入高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴反應2 h，煮沸15 min滅活后冷卻至室溫，再加入淀粉葡萄糖苷酶，在55 ℃下反應4 h，煮沸30 min，使酶失活后，離心(4 000 r/min，15 min)，使用透析袋(孔徑0.1 nm)將上清液用去離子水透析36 h，冷凍干燥得到一次酶解多糖。將一次酶解多糖配制成1 L質量分數(shù)0.5%的溶液，加入地衣聚糖酶，40 ℃水浴反應1 h；煮沸10 min滅酶后，離心(4 000 r/min，30 min)，上清液經(jīng)過透析袋(孔徑0.1 nm)透析36 h，冷凍干燥最終得到WEAX[13]。

1.4 膽酸鹽結合力測定

1)膽酸鹽標準曲線。參考周小理等[14]的研究方法并稍做改動，分別移取0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL的1 mmol/L STC和SGC標準溶液置于10 mL的具塞試管中，在620 nm波長處測定膽酸鹽溶液吸光值，繪制標準曲線。

由圖1可知，STC的標準曲線是y=0.73949x+0.00123，相關系數(shù)R2=0.999 66，SGC的標準曲線是y=0.70016x+0.03825，相關系數(shù)R2=0.997 84，二者均具有良好線性關系。

圖1 膽酸鹽標準曲線Fig.1 The standard curve of cholate

2)WUAX和WEAX膽酸鹽結合率的測定。分別稱取250、375、500、625、750 mg WEAX和WUAX置于50 mL的具塞試管中，加入5 mL的蒸餾水，放入37 ℃的搖床中，振蕩1 h充分混勻，加入10 mL的1 mmol/L的STC和SGC溶液，振蕩混勻，37 ℃下水浴1 h，離心(4 000 r/min，30 min)，收集上清液。利用標準曲線計算未吸附膽酸鹽的含量，從而得到膽酸鹽結合率。

3)反應時間對膽酸鹽結合量的影響。反應時間分別設置為20、30、40、60、90和120 min，稱取500 mg的AX，按照本文“1.4 2)”的步驟測定未吸附膽酸鹽的含量，根據(jù)膽酸鹽結合率的高低，得出最佳反應時間。

4)AX添加量對膽酸鹽結合量的影響。分別稱取250、375、500、625、750 mg的AX，依照本文“1.4 3)”得出的最佳反應時間，再按照本文“1.4 2)”的步驟測定未吸附膽酸鹽的量，根據(jù)膽酸鹽結合量的大小，得出最適AX添加量。

5)膽酸鹽的等溫吸附曲線。根據(jù)之前試驗結果分別得出最佳反應時間和最適AX添加量，分別加入濃度為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mmol/L的膽酸鹽溶液，按照本文“1.4 2)”的步驟計算膽酸鹽結合量，繪制等溫吸附曲線。

對于吸附等溫線用Freundlich方程進行擬合作圖，公式(1)如下：

(1)

式(1)中，Qe為平衡結合量，mg/g；Ce為平衡濃度；n為特征常數(shù)；Kf為平衡吸附常數(shù)。

1.5 胰脂肪酶活性抑制率測定方法

根據(jù)黃琳翔等[15]的方法，配制Tris-HCl緩沖液、胰脂肪酶溶液和4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)溶液。向96孔板中加入胰脂肪酶和緩沖液或AX樣品，37 ℃下反應30 min，添加PNPP,37 ℃下反應5 min，采用酶標儀每隔1 min測定1次吸光度，共測定20次。繪制“吸光度-時間”曲線，曲線的斜率即抑制胰脂肪酶的反應速率，胰脂肪酶抑制率計算公式如下：

(2)

式(2)中，K0為空白組的斜率,K1為樣品組的斜率。

1)WUAX和WEAX對胰脂肪酶抑制率測定。分別選取質量濃度為5、10、20、30、40 mg/mL的WUAX和WEAX，PNPP溶液的質量濃度為2.5 mg/mL，胰脂肪酶的質量濃度為100 mg/mL按照表1的添加量和順序加入到96孔板，在37 ℃下反應30 min，每隔1 min測定1次吸光度，共測20次，每個編號每種質量濃度均做3次平行。

表1 各物質添加量 Table 1 Addition amount of each substance

2)AX對胰脂肪酶的抑制可逆性分析。設置胰脂肪酶的質量濃度分別為50、75、100、125、150 mg/mL，AX質量濃度設定為5、30 mg/mL，按照本文“1.5 1)”的步驟測定反應速率，繪制胰脂肪酶反應速率-胰脂肪酶質量濃度曲線及擬合方程。

3)AX對胰脂肪酶的抑制作用類型分析。PNPP的質量濃度分別設置為1.25、2.50、3.75、5.00 mg/mL，AX質量濃度設定為5、30 mg/mL。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程繪制曲線并擬合，從而得到胰脂肪酶抑制類型，公式如下：

(3)

式(3)中，v為胰脂肪酶酶反應速率，A/min；vmax為最大反應速率，1/min；Km表示米氏常數(shù)；[I]為AX質量濃度，mg/mL；[S]為PNPP質量濃度，mg/mL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有指標的測試平行實驗不少于3次，使用SPSS 22.0計算平均值和標準差，通過單因素方差分析和多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，當P<0.05時判定數(shù)據(jù)間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 AX體外膽酸鹽結合力分析

1)WUAX與WEAX的膽酸鹽結合率。由圖2可看出，WEAX對STC和SGC的結合率低于15%。當WEAX質量濃度低于100 mg/mL時，結合率隨質量濃度的增加而增大，且具有顯著性差異(P<0.05)；當WEAX質量濃度高于100 mg/mL時，結合率變化趨于平緩，無顯著性差異(P>0.05)。WUAX對STC和SGC的結合率顯著高于WEAX，結合率隨著WUAX質量濃度增加而增大，具有顯著性差異(P<0.05)，當WUAX質量濃度為150 mg/mL時，對STC和SGC的結合率分別達到52.87%和38.30%。

同一曲線中不同字母表示具有顯著性差異，P<0.05，n=3，下同。Different letters in the same curve indicate significant differences,P<0.05,n=3,the same as below.

2)WUAX對膽酸鹽的吸附動力學分析。由圖3所示，在0～40 min內WUAX對STC的結合率隨反應時間延長而增加，具有顯著性差異(P<0.05)，在40 min后結合率變化趨勢無顯著性變化(P>0.05)。在0～90 min內，WUAX對SGC的結合率隨反應時間的延長而增加，具有顯著差異(P<0.05)，在90 min后，結合率變化趨于平緩。在40 min時，WUAX對STC的結合率為49.50%。在 90 min時，WUAX對SGC的結合率為32.33%。

圖3 WUAX對膽酸鹽的吸附動力學曲線Fig.3 Adsorption kinetics of WUAX to cholate

3)WUAX添加量對膽酸鹽結合量的影響。分別選取40 min和90 min為WUAX對STC和SGC的結合時間，進行膽酸鹽結合量測定。由圖4可知，當WUAX添加量低于375 mg時，對膽酸鹽的結合量隨其添加量的增加而增加，當WUAX添加量高于375 mg時，膽酸鹽的結合量呈現(xiàn)下降的趨勢。當WUAX添加量為375 mg時，對STC和SGC的結合量最大，分別為6.12、3.45 mg/g。

圖4 WUAX添加量對膽酸鹽結合量的影響Fig.4 Effect of WUAX supplemental level on cholate binding amount

4)WUAX對膽酸鹽的等溫吸附曲線及擬合方程分析。選取WUAX添加量為375 mg進行膽酸鹽等溫吸附曲線測定。由圖5可知，隨著膽酸鹽濃度的升高，WUAX對膽酸鹽的結合量逐漸增加，結合速率呈先增加后減緩的趨勢。WUAX對STC的結合量高于SGC。

圖5 WUAX對膽酸鹽等溫吸附曲線Fig.5 Isothermal adsorption curve of WUAX for cholate

如圖6所示，WUAX結合STC的擬合方程為lnQe=0.51lnCe+1.7567，結合SGC的擬合方程為lnQe=1.31lnCe+0.9883。

圖6 WUAX對膽酸鹽的等溫吸附擬合曲線Fig.6 Isothermal adsorption fitting curve of WUAX for cholate

2.2 AX體外抑制胰脂肪酶活性評價

1)WEAX和WUAX對胰脂肪酶活性的抑制。由圖7可知，當WUAX質量濃度大于5 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率變化趨于平緩，無顯著性差異(P>0.05)，當 WUAX質量濃度為30 mg/mL時，抑制率為18.30%。WEAX對胰脂肪酶的抑制率隨著質量濃度增加而增加，具有顯著性差異(P<0.05)，當WEAX質量濃度為30 mg/mL時，對胰脂肪酶抑制率為35.66%。WEAX對胰脂肪酶的抑制能力高于WUAX。

圖7 WUAX和WEAX對胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Pancreatic lipase inhibition rates of WUAX and WEAX

如圖8所示，當WEAX質量濃度低于30 mg/mL時，隨著質量濃度的增加，其對胰脂肪酶的抑制率也隨之增加。當WEAX的質量濃度高于30 mg/mL時，其對胰脂肪酶的抑制率變化趨于平緩。當WEAX質量濃度為30 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率達35.93%。

圖8 WEAX質量濃度對胰脂肪酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of pancreatic lipaseby WEAX concentration

2)WEAX對胰脂肪酶抑制可逆性分析。由圖9可知，WEAX質量濃度在5 mg/mL和30 mg/mL時，擬合曲線交于原點，故WEAX對胰脂肪酶的抑制是可逆性抑制，隨著WEAX質量濃度的增加，其斜率降低，并且反應速率曲線都通過坐標原點。

圖9 WEAX對胰脂肪酶抑制的可逆性Fig.9 Reversibility of pancreaticlipase induced by WEAX

3)WEAX對胰脂肪酶的抑制類型分析。由圖10可知，隨著WEAX的質量濃度從5 mg/mL增加至30 mg/mL，擬合曲線的斜率增大，即1/v增大，vmax減小，在橫坐標的截距也隨之增大，即Km增大。擬合后2條擬合曲線交于第二象限，說明WEAX對胰脂肪酶的抑制類型是混合型抑制。

圖10 WEAX對胰脂肪酶的Lineweaver- Burk方程擬合曲線Fig.10 Lineweaver-Burk equation fitting curveof pancreatic lipase by WEAX

3 討 論

本研究以小麥麥麩WUAX和WEAX為對象，研究了2種具有不同結構特性的AX對膽酸鹽的結合力和胰脂肪酶抑制活性。結合膽酸鹽實驗結果表明，WUAX結合膽酸鹽的能力強于WEAX。Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)膽酸鹽結合力會隨著其中不溶性纖維含量的增多而升高，這可能是WUAX對STC和SGC的結合力高于WEAX的原因。WUAX對STC結合率和結合量大于SGC，與段振等[17]研究結果相同。相較于SGC側鏈上的甘氨酸羧基，STC側鏈基團的磺酸基的極性更強，更容易暴露結合位點，在不聚集的狀態(tài)下更易被多糖結合[18-19]。WUAX對膽酸鹽的結合量隨其添加量的增加而增加，當添加量為375 mg時，膽酸鹽結合量最大。劉榮等[20]研究表明水溶性黑木耳多糖對膽酸鹽的結合量會隨著多糖添加量的增加而達到峰值，與本試驗結果相似。此時溶液中的WUAX達到飽和，當添加量繼續(xù)增大時會因為WUAX的黏度增大而使得其結合量下降[21]。WUAX對STC的結合量高于SGC，這與紀秀鳳等[22]對于紅樹莓籽花青素結合膽酸鹽的實驗結果相似。WUAX的等溫吸附曲線擬合方程的相關系數(shù)R2分別是0.971 2和0.972 4，說明擬合方程具有線性關系，符合Freundlich方程。在Freundlich方程中，1/n代表濃度或添加量對結合量影響的強弱，1/n越小，結合性能越好。當0.1<1/n≤0.5時，代表容易結合；當0.5<1/n≤1時，表明不易結合；當1/n>1時，表明結合困難。WUAX對STC和SGC擬合方程的1/n分別為0.51和1.31，說明相對于SGC，WUAX較易與STC結合[23]。

胰脂肪酶抑制活性實驗結果表明：WEAX對胰脂肪酶的抑制能力高于WUAX，這可能因為WEAX所形成的高黏性溶液能更有效降低胰脂肪酶的活性[6]。WEAX對胰脂肪酶的抑制率隨著質量濃度增加先升高后趨于平緩，黃琳翔等[15]和周巧杰等[24]試驗結果中胰脂肪酶抑制率變化與本研究一致，原因可能是WEAX與胰脂肪酶的結合達到飽和狀態(tài)使得抑制率趨于平緩。根據(jù)酶和抑制劑的結合特性，可分為可逆性抑制和不可逆性抑制，酶反應速率曲線經(jīng)過原點的為可逆性抑制，不經(jīng)過原點的是不可逆性抑制[25]。WEAX對胰脂肪酶是可逆性抑制，與酶結合是通過非共價鍵的形式，從而影響酶的活性[26]。酶的反應速率曲線變化趨勢及交點與于洋君等[27]和張靜等[28]研究可逆性抑制結果一致。Lineweaver-Burk方程擬合曲線結果表明WEAX對胰脂肪酶的抑制類型是混合型抑制。Liu 等[26]研究了紅米多酚對胰脂肪酶活性的抑制，結果表明抑制類型為混合型抑制，與本研究得出的抑制類型相符合。混合型抑制即WEAX作為酶抑制劑，既可以與游離的酶反應，又可以與酶和底物的復合物反應，從而抑制胰脂肪酶的活性[29]。

綜上所述，WUAX對膽酸鹽的結合力顯著高于WEAX，而WEAX對胰脂肪酶抑制活性高于WUAX。這些體外降脂作用的差異與2種AX的結構特性不同有關。基于此,筆者所在課題組后續(xù)將進一步對AX結構與降脂作用的關系進行研究，為AX降脂機制的探究提供參考。