血府逐瘀湯聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠ERK/MAPK信號通路的調節作用

陳燕偉 馬善波 張蕊

(空軍軍醫大學西京醫院1.神經外科；2.藥劑科;3.耳鼻喉科，陜西 西安 710032)

腦膠質瘤是臨床常見的原發性顱腦惡性腫瘤之一，發病率約占顱內腫瘤的35.2%～61.0%[1]。由于腦膠質瘤的發病機制尚不明確，在臨床治療中有發病率及死亡率高，治愈率低等特點[2]。替莫唑胺為常用的治療腦膠質瘤的藥物之一，其在臨床應用中存在有效率低、不良反應大等缺點[3]，所以對于腦膠質瘤治療藥物的研發成為目前的臨床工作重點之一。血府逐瘀湯是以中醫學理論為指導的具有活血化瘀等作用的中藥湯劑，近年來研究發現其在腦膠質瘤的臨床治療中有顯著效果[4-5]。ERK/MAPK信號通路是與細胞增殖分化功能相關的重要信號通路之一，研究報道[6-7]其在體內的表達水平與腦膠質瘤的發生、發展及預后等密切相關。本文探討血府逐瘀湯聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠的作用及機制，旨在為腦膠質瘤的治療及血府逐瘀湯的藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，雄性，8月齡，體重200～240g，購自山東大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(魯) 2019 0001]，在實驗動物房飼養，溫度20～25℃，濕度40%～60%，自由進食水；C6膠質瘤細胞(中科院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑 血府逐瘀湯(由桃仁12g，紅花、當歸、生地黃、牛膝各9g，川芎、桔梗各4.5g，赤芍、枳殼、甘草各6g，柴胡3g組成)由藥材飲片制成生藥含量為5g/mL的湯劑，購自北京同仁堂藥業公司(批號201908151)；替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業有限公司，批準文號：H20040637，規格：50mg)；ERK、p38MAPK兔單克隆抗體、超敏ECL化學發光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IGg、生物素標記山羊抗兔IGg、大鼠TGF-β1檢測試劑盒(碧云天生物公司，貨號AF1051、AF7668、P0018M、A0208、A0277、PT878)；總RNA提取試劑盒、一步法逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、大鼠IL-2檢測試劑盒、大鼠IL-10檢測試劑盒、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號R1200、T2240、SR1110、SEKR-0003、SEKR-0006、G1120)；F-12K培養基(上海雅吉生物科技有限公司，貨號P007)；小鼠抗大鼠CD4+CD25+-FITC單克隆抗體(英國AbD Serotec公司，貨號DC040)；CD8+T細胞(艾美捷科技有限公司，貨號MAB4598)。PCR引物設計及合成由賽默飛世爾科技公司完成。

1.3 設備及儀器 DM2500光學/熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；HM355S 全自動切片機、E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司)；3-18KS臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)CytoFLEX S 流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 60只大鼠隨機分為空白對照組、腦膠質瘤組、血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組，每組各12只，除空白對照組外，其余大鼠按照參考文獻方法[8]進行造模，C6膠質瘤細胞復蘇傳代，并保證細胞活力在90%以上。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，頭、背部表面消毒后沿中線切開，暴露顱骨，在前冠狀縫與矢狀縫交點前1.0mm、右3.0mm 處鉆一小孔，直徑為1.0mm。沿鉆孔垂直進針，每只大鼠緩慢注射25μL的C6膠質瘤細胞，10min后退針，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚并切口消毒，并在手術后對動物觀察一小時，常規飼養，10d后以大鼠出現自主活動障礙，顱內壓升高，磁共振成像可見類圓形腫塊及環狀強化長 T1低信號、長T2高信號視為造模成功[8]。血府逐瘀湯組按照20g/kg灌胃給予血府逐瘀湯[9]，替莫唑胺組給予替莫唑胺(25mg/kg)[10]，聯合給藥組同時給予血府逐瘀湯及替莫唑胺，空白對照組及腦膠質瘤組給予蒸餾水，1次/d，連續5w[10]。對大鼠的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會同意批準。

1.4.2 大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞、CD8+T細胞測定 大鼠取血后置于肝素潤洗過的離心管中，參照文獻方法[11]測定大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞、CD8+T細胞百分比。

1.4.3 大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率測定 每組取6只大鼠，末次給藥后處死，取腫瘤組織并稱重，計算瘤重占腦重比及抑瘤率。瘤重占腦重比=(瘤重)/腦重×100%，抑瘤率=(腦膠質瘤組瘤重占腦重比-給藥組瘤重占腦重比)/腦膠質瘤組瘤重占腦重比。

1.4.4 大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平測定 取大鼠腫瘤組織(空白對照組取正常腦組織)，研磨勻漿取上清液，按照試劑盒方法測定大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平。

1.4.5 大鼠腦組織病理學檢查 每組取6只大鼠腦組織，在中性甲醛中固定后進行4μm石蠟切片，經常規HE染色后光鏡下觀察。

1.4.6 腦膠質瘤組織ERK、p38MAPKmRNA水平測定 取大鼠腦膠質瘤組織，空白對照組取正常腦組織，提取總RNA并逆轉錄為cDNA，以GAPDH作為內參，使用試劑盒進行qRT-PCR檢測，結果以2-ΔΔCT法計算基因表達量。引物序列為：GAPDH: 正向引物5′-AACAAGAATGGTGGGCAGTC-3′，反向引物5′-AACTCCTCGTCCGTCTGTC-3′；ERK:正向引物5′-TTGAGACCCTGGTGGACATC-3′，反向引物5′-CTACCAAAGTTCCCCCTCTC-3′；P38MAPK:正向引物5′-GATTTTTCACGACACCCTTCACC-3′，反向引物5′-GGTCCTCTGGTCAAACTCTTGGAG-3′。

1.4.7 Western blot檢查腦膠質瘤組織ERK、p38MAPK蛋白水平 取腫瘤組織(空白對照組取正常腦組織)，裂解并勻漿后，以8000rpm離心10min，收集上清液，水浴煮沸變性后測定蛋白濃度，取50μg蛋白電泳分離，用ERK、p38MAPK、GAPDH兔單克隆抗體(1∶500稀釋)及二抗(1∶1000稀釋)孵育后，滴加顯影劑，凝膠成像后使用ImageJ進行定量分析。

1.4.8 免疫組化檢查腦膠質瘤組織ERK、p38MAPK表達水平 取大鼠腦膠質瘤組織(空白對照組取正常腦組織)5μm石蠟切片，脫蠟、復水后進行抗原修復，切片經ERK、p38MAPK兔單克隆抗體(1:200稀釋)在 4℃條件下孵育過夜，洗滌后，切片經山羊抗兔二抗室溫孵育2h，二氨基聯苯胺顯影，顯微鏡下拍照并使用Image-Pro Plus 6.0測定免疫組化積分光密度。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞、CD8+T細胞水平比較 與空白對照組比較，腦膠質瘤組大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞數升高(P<0.05)，CD8+T細胞數降低(P<0.05)；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組外周血CD4+CD25+調節性T細胞數降低(P<0.05)，CD8+T細胞數升高(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞數降低(P<0.05)，CD8+T細胞數升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調節性T細胞、CD8+T細胞水平

2.2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較 與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)；抑瘤率計算結果表明，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組抑瘤率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較

2.3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較 與空白對照組比較，腦膠質瘤組腫瘤組織IL-2水平降低(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平升高(P<0.05)；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較

2.4 各組大鼠腫瘤組織病理變化的影響 空白對照組大鼠腦組織未見明顯病理學變化，與空白對照組比較，腦膠質瘤組大鼠腦組織可見明顯腫瘤細胞浸潤，細胞排列不整齊，邊界不清晰；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組大鼠腦組織腫瘤細胞浸潤明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腫瘤組織病理學變化(HE200×)

2.5 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平的影響 與空白對照組比較，腦膠質瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平升高(P<0.05)；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組腦膠質瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平比較

2.6 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平的比較 與空白對照組比較，腦膠質瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 蛋白水平升高(P<0.05)；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平

2.7 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平比較 與空白對照組比較，腦膠質瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 免疫組化IOD水平升高(P<0.05)；與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平

3 討論

腦膠質瘤是由于腦神經膠質細胞在高電離輻射、遺傳因素、病毒感染等多種因素影響下發生基因突變而引起的腫瘤疾病，其5年病死率在全身腫瘤疾病中位居第三位[12]。目前臨床上對于腦膠質瘤的治療存在復發風險高、不良反應大、患者生存質量低等多種缺點，所以對于治療腦膠質瘤的藥物開發仍是臨床的迫切需求。

血府逐瘀湯是基于中醫學理論形成的具有活血化瘀療效的中藥成方制劑，其出自中醫學著作《醫林改錯》，中醫常用其治療各種血瘀證，在現代醫學中常用于治療腦震蕩后遺癥、腦血栓等多種心腦血管疾病[13-14]。近年來臨床研究發現，血府逐瘀湯對于腦膠質瘤具有顯著的治療作用，其中呂廣梅[4]、門艷芳等[5]先后報道了血府逐瘀湯治療腦膠質瘤取得顯著成效的臨床案例，并指出血府逐瘀湯能夠抑制中晚期膠質瘤患者腫瘤進展，提高化療療效并減少化療相關性不良反應。

外周血CD4+CD25+調節性T細胞是機體內的免疫調節細胞，其發揮免疫抑制作用進而誘導腫瘤疾病的發生發展[15]，而CD8+T細胞作為特異性T細胞能夠分泌細胞因子，進而促進T淋巴細胞對病毒、腫瘤細胞等的殺傷作用[16]。IL-2主要由活化的T細胞產生，起到免疫促進作用，誘導自然殺傷細胞增殖，促進B細胞增殖及抗體的產生，進而發揮對腫瘤細胞的殺傷作用[17]；腦膠質瘤細胞能夠分泌TGF-β1，促進神經小膠質細胞分化并分泌IL-10、TGF-β1等因子，起到免疫抑制作用，并進一步促進了腫瘤細胞的增殖。本實驗結果表明，與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組外周血CD4+CD25+調節性T細胞數、腫瘤組織IL-10、TGF-β1水平降低，CD8+T細胞數、IL-2水平升高，且聯合給藥組變化更明顯，這表明血府逐瘀湯聯合替莫唑胺能夠通過調節自身免疫功能，激活體內免疫過程，增強體內淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，進而發揮對腫瘤進展的抑制作用。

ERK/MAPK信號通路在細胞因子、神經遞質等刺激因素作用下被激活，進而細胞分化、細胞增殖、凋亡和自噬、運動性、學習記憶和新陳代謝等細胞生命活動[18]。在腫瘤疾病的發生發展中，ERK/MAPK信號通路接受生長因子、環境刺激等信號，通過信號級聯反應作用于NF-кB等核轉錄因子，誘導腫瘤進展，在乳腺癌、膠質細胞瘤等腫瘤組織中都可發現ERK/MAPK的過度激活[19-20]。金戈等[21]研究發現ERK通路異常激活會增強腦膠質瘤 U251 細胞增殖能力，而抑制ERK通路及相關蛋白則能夠顯著抑制U251 細胞增殖；張靜等[21]通過對人腦膠質瘤組織樣本的臨床研究發現，在腦膠質瘤組織中MAPK通路相關蛋白過度激活，并指出MAPK通路的異常激活在腦膠質瘤的發生、發展中發揮重要作用；由此可見調節ERK/MAPK通路可能是腦膠質瘤治療的新的方向。本實驗結果表明，與腦膠質瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯合給藥組大鼠腫瘤組織ERK、p38MAPK mRNA水平及蛋白水平、免疫組化表達水平均降低，且血府逐瘀湯聯合替莫唑胺組對ERK、p38MAPK表達的抑制作用更明顯，提示血府逐瘀湯聯合替莫唑胺對腦膠質瘤的抑制作用可能是通過抑制ERK/MAPK通路實現的。由于時間及實驗條件的限制，本實驗尚未能研究血府逐瘀湯聯合替莫唑胺對腦膠質瘤大鼠ERK/MAPK通路上下游其他相關蛋白的調節作用及對ERK、p38MAPK的靶向調節作用，擬在今后的研究中對上述問題做進一步討論，并就血府逐瘀湯聯合替莫唑胺對ERK/MAPK通路相關蛋白的反饋性調節作用進行闡述。

4 結論

血府逐瘀湯聯合替莫唑胺能夠抑制腦膠質瘤大鼠腫瘤進展，調節大鼠免疫功能，其機制可能與調節ERK/MAPK信號通路有關。