SOX21在胃癌中的表達和甲基化狀態及對體外胃癌細胞的作用*

李麗萍 賈筠 蔡永昌 賴慶君 彭堯

(1.東莞市人民醫院腫瘤內科四區，廣東 東莞 523059; 2.東莞市人民醫院腫瘤內科，廣東 東莞 523059;3.東莞市人民醫院胃腸外科，廣東 東莞 523059;4. 廣州醫科大學基礎醫學院，廣東 廣州 510095)

胃癌(gastric cancer，GC)是世界上第四大最常見的癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第二大原因。2018年，胃癌的發病率在全球排名第六，新增病例為1,033,701例(占所有癌癥類型的新增病例的5.7%)[1]。癌癥作為一種復雜的多因素疾病，是遺傳學和表觀遺傳學途徑之間相互作用的結果。表觀遺傳學研究表明，DNA甲基化通過干擾DNA和染色質分子結構在促進胚胎發育、衰老和許多類型的癌癥中必不可少[2]。促癌基因啟動子低甲基化和抑癌基因啟動子高甲基化是腫瘤的一個重要的特征。因此，基因的異常甲基化可以作為不同癌癥類型的標志，并可用于癌癥的診斷和分類[3]。性別決定區Y-BOX 21(sex-determining region Y- box 21，SOX21)是SOX家族蛋白質B2組的成員之一，位于13q32.1染色質上，具有高遷移率基團DNA結合域，在胚胎發育、神經和牙齒形成等過程中發揮重要作用[4]。最近的研究表明，在大腸癌組織中，SOX21基因啟動子甲基化率明顯高于癌旁組織，SOX21基因啟動子甲基化可作為大腸癌患者糞便和血漿中一種潛在的非侵入性診斷標志物[5]。目前，關于SOX21基因在胃癌中的甲基化狀態及對胃癌細胞的作用尚不明確。Wnt信號通路影響細胞生長、胚胎發育、腫瘤細胞分裂、增殖、腫瘤發展、轉移和預后[6]。Zhou W等[7]通過實驗證明抑制Wnt/β-catenin信號通路，可抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成。本研究探討SOX21在胃癌組織中的表達及甲基化水平，進一步分析SOX21是否通過調控Wnt/β-catenin信號通路在胃癌細胞中發揮作用，以期為明確胃癌的發病機制、開發新的胃癌診斷靶點及治療策略提供新的科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年4月～2017年5月于東莞市人民醫院行胃癌根治術患者的癌組織及對應的癌旁組織各44例。其中男23例，女21例，年齡34～71歲，平均(53.181±10.775)歲。納入標準：①患者經影像學及組織學檢查診斷為原發性胃癌。②患者術前未進行放、化療及生物治療。③患者無其他腫瘤或重大疾病。④組織標本經我院病理科鑒定，確認為癌組織及癌旁組織。

1.2 主要材料 胃癌細胞株AGS和人胃粘膜上皮細胞株GES-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SOX21過表達慢病毒液(簡稱SOX21)及其陰性對照慢病毒液(簡稱NC)購自武漢金開瑞生物工程有限公司；DNA提取試劑盒和DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SOX21抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；β-catenin、c-myc、cyclinD1、MMP7和GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及慢病毒轉染 AGS和GES-1細胞用含10% FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，收集細胞。MSP檢測AGS和GES-1細胞中SOX21啟動子甲基化狀態，qRT-PCR和Western blot檢測SOX21的表達。此外，將對數期生長的AGS細胞接種于6孔板中(4×105個/mL)，繼續培養24h后，將細胞分為空白對照組、NC組和SOX21組。棄去細胞培養基，添加含有6μg/mL polybrene的2mL新鮮培養基，NC組和SOX21組分別加入NC和SOX21慢病毒液各70MOI，空白對照組加入等量PBS，細胞繼續培養24h后，更換新鮮培養基繼續培養。48h后進行后續實驗。

1.3.2 甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)檢測組織和細胞SOX21啟動子甲基化狀態 收集AGS和GES-1細胞，GC組織及其癌旁組織，按照DNA提取試劑盒說明書提取細胞和組織的總DNA并測定DNA濃度及純度。取1000ng DNA樣品，參照DNA重亞硫酸鹽轉化試劑盒說明書進行DNA重亞硫酸鹽轉化及DNA純化。根據SOX21基因序列信息，利用 Methyl Primer Express v1.0 軟件設計SOX21基因的甲基化引物和去甲基化引物。甲基化上游引物：5′- ATGGAATTCTCTTCTTGGCT CCGGGCAGGGTG-3′，甲基化下游引物；5′-ATGA AGCTTCTGAGCCGGTGCAGAGGGCG-3′；去甲基化上游引物：5′-ATGGAATTCGTTTAGGCGAGTG GAGAGTCCG-3′，去甲基化下游引物：5′-ATGCTCG AGAATCTTTAGGACAAAACTGAGC-3′。 擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環；72℃ 10 min。反應結束后，PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.3 qRT-PCR檢測SOX21 mRNA表達 Trizol法提取細胞和組織總RNA，并將RNA逆轉錄合成cDNA。根據SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書檢測SOX21 mRNA表達。反應條件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、34s，40個循環。SOX21以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算其mRNA表達。SOX21上游引物：5′- GCACAACTCGGAGATCAGCA-3′， SOX21下游引物：5′-CCGGGAAGGCGAACTTGTC-3′； GAPDH上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′， GAPDH下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.3.4 免疫組化檢測組織中SOX21表達 GC組織及其癌旁組織用4%多聚甲醛固定72h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。常規脫蠟至水，3% H2O2避光孵育15min，PBS清洗后，5%BSA避光孵育1h，SOX21抗體(1∶200)4℃孵育過夜。二抗(1∶400)避光孵育1h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色5min。自來水沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化10s。0.2%氨水做返藍處理8s。切片經自來水沖洗后，進行脫水、透明處理，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察分析。通過染色強度和面積分數的總和評估IHC分數。 染色強度：0表示無染色，1表示弱染色，2表示中度染色，3表示強染色。 染色面積：0表示0%～5%，1表示6%～25%，2表示26%～50%，3表示> 50%。

1.3.5 Western blot檢測SOX21和Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達 RIPA裂解液裂解細胞或組織，收集上清，BCA法測定其蛋白濃度。取各樣品30μg蛋白進行SDS-PAGE分離，濕轉法將膠塊中的蛋白轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，SOX21抗體(1∶1000)、β-catenin抗體(2∶1000)、c-myc抗體(2∶1000)、cyclinD1抗體(2∶1000)、MMP7抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過夜， 二抗(1∶5000)室溫孵育1h。 ECL發光液顯色，暗室曝光。

1.3.6 CCK-8試劑盒檢測細胞活力 將慢病毒感染后的AGS細胞接種于96孔板(5×103個細胞/孔)，細胞繼續培養12、24、48、72h后，向每孔細胞中加入10μL CCK-8，37℃條件下孵育3h。酶標儀測定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.3.7 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 0.25%胰酶消化慢病毒感染后的AGS細胞，新鮮培養基重懸細胞。取200個AGS細胞接種于培養皿中，細胞于37℃、5% CO2培養箱中持續培養2周。PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染液染色1h，流水緩慢洗去染液，空氣干燥，觀察細胞克隆形成數量。

1.3.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 將AGS細胞接種于6孔板(5×106個細胞/mL)，繼續培養24h 。收集AGS細胞，加入300μL 的1×Binding Buffer 重懸細胞。加入5μL的Annexin V-FITC，室溫避光孵育15min。隨后再加入5μL的PI染色，補加200μL的1×Binding Buffer，立即上流式細胞儀檢測。

1.3.9 Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力 遷移實驗：上腔室加入100μL 含5×104個AGS細胞的細胞懸液，下腔室加入500μL含20% FBS的DMEM培養基，37℃、 5%CO2條件下培養24h。5%戊二醛4℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30min，顯微鏡下觀察。侵襲實驗：無血清DMEM培養基稀釋Matrigel。取100μL稀釋液加入上腔室中，37℃孵育至凝固。隨后按照遷移實驗步驟進行后續實驗。

2 結果

2.1 SOX21在胃癌組織中的甲基化率及表達水平 與癌旁組織相比，GC組織中SOX21甲基化率明顯升高(P<0.001)，SOX21 IHC評分、mRNA表達和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 SOX21在胃癌組織中的甲基化及表達水平

表1 GC組織和癌旁組織中SOX21甲基化狀態

2.2 SOX21在胃癌細胞中的甲基化及表達水平 SOX21在GES-1細胞中呈去甲基化狀態，而在AGS中呈完全甲基化狀態。與GES-1細胞相比，AGS細胞中SOX21 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 SOX21在胃癌細胞中的甲基化及表達水平

2.3 過表達SOX21對胃癌細胞增殖的影響 與NC組相比，SOX21組中SOX21 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05)，24、48、72h細胞活力明顯降低(P<0.05)，克隆形成數明顯降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 過表達SOX21對胃癌細胞增殖的影響

2.4 過表達SOX21對胃癌細胞凋亡的影響 與NC組相比，SOX21組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 過表達SOX21對胃癌細胞凋亡的影響

2.5 過表達SOX21對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 與NC組相比，SOX21組遷移和侵襲細胞數明顯降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 過表達SOX21對胃癌細胞遷移和侵襲的影響(200×)

2.6 過表達SOX21對Wnt/β-catenin通路的影響 與NC組相比，SOX21組細胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1和MMP7蛋白表達均明顯降低(P<0.05),見圖6。

圖6 過表達SOX21對Wnt/β-catenin通路的影響

3 討論

GC是消化系統最常見的惡性腫瘤之一。80%的GC患者早期無明顯癥狀，確診時已進入晚期，盡管進行了胃切除術和化療治療，患者的5年生存率仍然不到20%[8]。因此，GC的早期診斷和治療尤為重要。DNA甲基化作為表觀遺傳學的一種表現形式，是基因表達調控的重要機制。啟動子的異常甲基化在腫瘤早期診斷、療效預測、預后評估和指導個體化治療等方面具有重要作用[9]。SOX21在膠質瘤形成過程中可能通過改變SOX 2和SOX 21之間的平衡而發揮腫瘤抑制作用，SOX2/ SOX21軸可能成為膠質瘤新的治療靶點[10]。

SOX13是BOX家族D組成員之一，是胚胎發育和軟骨形成的重要調節因子。SOX13在腫瘤組織中的表達高于在配對的非腫瘤組織中的表達。SOX13表達上調與肝癌患者分化差、轉移、復發、總體及無瘤生存率差有關[11]。SOX6和SOX21可能是膠質母細胞瘤的一個預后標志物和潛在的治療靶點[2]。對結直腸癌組織和糞便標本進行檢測發現，SOX21基因啟動子發生異常高甲基化[13]。此外，已有研究表明，從正常胃黏膜組織經由萎縮性胃炎最后發展到胃癌過程中，SOX21蛋白表達量逐漸下調，提示SOX21在胃癌中可能發揮著抗腫瘤作用[14]。本研究結果顯示，SOX21基因啟動子在GC組織中呈異常甲基化狀態，SOX21表達下調。同樣的，在GC細胞株中SOX21基因啟動子也發生異常甲基化，SOX21表達下調。過表達SOX21后，GC細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯下調，細胞凋亡率明顯上調。該結果表明，SOX21在胃癌中發揮著抗腫瘤作用。

有證據表明，Wnt/β-catenin信號過度激活廣泛存在于不同惡性腫瘤中，尤其是消化系統腫瘤，因此靶向抑制Wnt/β-catenin通路在抑制腫瘤進展方面具有巨大應用潛力[15]。研究表明，促進Wnt/β-catenin信號通路的主要級聯基因，包括WNT11、FZD家族和DVL2，在高危侵襲性胃腸道間質瘤中上調[16]，該結果表明Wnt/β-catenin信號通路的激活對侵襲性胃腸道間質瘤的發生發展具有重要意義。腫瘤壞死因子受體超家族成員11B促進了GC細胞的侵襲，并激活了Wnt/β-catenin信號通路[17]。維甲酸相關孤兒受體可通過下調Wnt/β-catenin信號通路，抑制胃癌細胞增殖、上皮-間質轉化和侵襲[18]。同樣的，沉默T-box3可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3α、β-catenin和c-myc的表達，抑制Wnt/β-catenin通路激活，從而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[19]。李萍等的研究結果也表明，上調Wnt/β-catenin通路中Wnt、β-catenin、cyclinD1和c-myc的表達可促進胃癌細胞增殖并抑制凋亡[20]。本研究結果顯示，過表達SOX21后，可下調Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、c-myc、cyclinD1和MMP7蛋白表達。

4 結論

SOX21基因啟動子在GC組織和細胞中異常甲基化，過表達SOX21可能通過下調Wnt/β-catenin信號通路抑制GC細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。本研究結果為明確胃癌的發病機制、開發新的胃癌診斷靶點及治療策略提供了新的科學依據。