腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體和gDNA標準物質的研制

趙琳娜，劉 娜，王學碩，崔生輝*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

致瀉性大腸埃希氏菌引起的腹瀉是世界范圍內存在的一個重要的公共衛生問題[1]。根據毒力因子、致病機理和流行病學特征，致瀉性大腸埃希氏菌可分為5 類：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenicEscherichia coli，EPEC）、腸道產毒性大腸埃希氏菌（enterotoxigenicE.coli，ETEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasiveE.coli，EIEC）以及腸道集聚性大腸埃希氏菌（enteroaggregativeE.coli，EAEC）[2-3]。EAEC是一類新發現的致瀉性大腸埃希氏菌，已在世界各國引起散發或暴發[4]。美國國立衛生研究院已將EAEC歸為B類生物恐怖病原體[5]。我國各省市致瀉大腸埃希氏菌流行特征分析結果顯示，EAEC在食源性致瀉大腸埃希氏菌中最常見，為主要毒力基因型[6-9]。因此食品中EAEC快速準確的檢測工作對預防和控制由其引起的細菌性食物中毒事件有著非常重要的作用。

EAEC傳統的鑒定方法包括分離培養、生化鑒定、血清學鑒定和16S rDNA鑒定等[10]，這些方法實驗周期較長，且存在一定的局限性。目前聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術由于其靈敏度高、可靠性強等優點被廣泛應用于EAEC的檢測中[11-13]。GB 4789.6—2016《食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[14]規定對生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行集聚熱穩定性毒素A基因（enteroaggregative heatstable enterotoxin A，astA）、集聚黏附菌毛調節基因（aggregative adhesive fimbriae regulator，aggR）、腸定植因子基因（protein involved in intestinal colonization，pic）3 個特征性基因的PCR鑒定，每次PCR需要使用EAEC標準菌株及其gDNA作為陽性對照，以保證結果的準確性。由于復雜的食品基質背景、培養基、試劑、DNA提取、人員操作等原因可直接影響檢測結果的準確性，所以在檢測過程中需要穩定的微生物標準物質和DNA標準物質對整個檢驗過程進行質量控制，從而保證檢測數據的準確性和有效性[15]。目前國內對于EAEC菌體標準物質及其基因組DNA（genomic DNA，gDNA）標準物質鮮見相關的研究報道。

自21世紀初，基因測序技術取得突破性進展[16]，基因測序獲得的數據量、測序速度和費用都得到大幅度改觀[17]。在國內，單個微生物基因組測序的費用也從數萬元降低至目前幾百元。通過對食源性微生物基因組進行測序、組裝，能夠獲得90%以上的細菌DNA信息，包括種屬、耐藥基因、毒力因子、轉移元件等信息，可對多個細菌間的基因組信息進行比對分析，在細菌鑒定、耐藥機制和溯源等研究中發揮重要的作用。

本研究針對目前檢驗領域需求，利用高通量測序技術對EAEC CMCC 44841進行全基因組測序，研制基因組信息背景清晰、穩定性良好的即用型EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質，可應用于我國食品檢驗機構。從而促進我國食品安全檢測水平的進一步提高，為及時發現問題提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EAEC CMCC 44841來源于中國醫學細菌保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar，TSA）美國BD公司；生理鹽水 國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302） 天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP 日本Takara公司；瓊脂糖 美國Oxoid公司。

1.2 儀器與設備

FreeZone12L冷凍干燥機 德國Labconco公司；PL2002電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物安全柜、205050GC恒溫培養箱、LEGEND Micro21R冷凍離心機、NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀、Qubit熒光定量測定儀 美國Thermo公司；FORMA恒溫搖床 西班牙IUL公司；VITEKCompact 2自動微生物分析系統 法國梅里埃公司；Autoflex飛行時間質譜 德國Bruker公司；C1000 PCR儀、紫外凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說明書。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測定儀檢測基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組測序。

1.3.2 細菌全基因組測序及生物信息學分析

經電泳檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段，進行末端修復、加A尾和測序接頭、純化和PCR擴增等步驟完成文庫制備。使用Qubit2.0和Agilent2100對構建好的文庫進行初步定量和插入片段檢測。插入片段符合預期后，使用Q-PCR對文庫的有效濃度進行準確定量。文庫檢測合格后采用北京諾禾致源科技股份有限公司的Illumina NovaSeq 6000測序系統進行全基因組測序。對Illumina測序平臺的數據進行低質量過濾，包括去除無效信號、去除測序接頭和錨定引物序列、去除復雜序列和重復序列，從而獲得高質量的有效數據（Clean Data）進行后續分析。使用SOAPdenovo軟件進行組裝，用RAST對組裝序列進行注釋（http://rast.nmpdr.org）。使用基因組流行病學中心（Center for Genomic Epidemiology，CGE）的默認閾值，對組裝序列進行鑒定（http://www.genomicepidemiology.org），利用美國病原體系統資源整合中心（Pathosystems Resource Integration Center，PATRIC）工作系統對基因組組成進行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGE VirulenceFinder在線數據庫對血清分型、MLST分型和毒力基因進行分析。

1.3.3 特征性基因PCR檢測

將提取的CMCC 44841基因組DNA定量后，分別進行10 倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4系列濃度，參照GB 4789.6—2016[14]中引物序列和PCR檢測方法，進行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增和靈敏度檢測，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.3.4 標準物質的生產制備

1.3.4.1 EAEC菌體標準物質的制備

取CMCC 44841一代新鮮培養物，劃線接種于TSA平板，36 ℃培養24 h。用無菌棉簽從平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的凍干保護劑中，渦旋混勻，用移液槍吸取20 μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機中冷凍干燥。將凍干后的菌球置于2 mL的西林瓶中，利用冷凍干燥機進行真空壓蓋密封。最終制備成EAEC含量為103CFU/樣品的菌球。

1.3.4.2 EAEC gDNA標準物質的制備

將純度A260nm/A280nm為1.7的20 μg DNA加入到20 mL含有葡聚糖的凍干保護劑中，用移液槍吸取20 μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機中進行冷凍干燥，最終制備成含量為20 ng/樣品的菌球。將凍干后的菌球放入2 mL的西林瓶中，將膠塞虛掩的蓋在西林瓶上，然后用冷凍干燥機進行真空壓蓋。

1.3.5 標準物質均勻性測試

1.3.5.1 EAEC菌體標準物質均勻性測試

根據標準物質均勻性研究抽取樣品數量要求[18]，從制備的一批600 瓶標準物質中隨機抽取20 瓶樣品，每瓶樣品充分溶于1 mL生理鹽水，使用螺旋涂布儀E50模式在TSA平板上進行螺旋涂布，每個樣品2 個平行。36 ℃培養24 h后對平板進行菌落計數。根據CNAS-GL003[19]對計數結果進行單因子方差分析，評價樣品的均勻性。

1.3.5.2 EAEC gDNA標準物質均勻性測試

根據標準物質均勻性研究抽取樣品數量要求[18]，從制備的一批300 瓶標準物質中隨機抽取10 件樣品，向每瓶標準物質樣品加入100 μL ddH2O，充分溶解，制備成20 ng/100 μL的DNA樣品，取2 μL作為模板，參照GB 4789.6—2016[14]中引物序列和PCR檢測方法，進行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴增。

1.3.6 標準物質穩定性測試

1.3.6.1 運輸穩定性

將制備的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質分別存放于25 ℃和37 ℃條件下，EAEC菌體標準物質模擬實驗周期為7 d，分別于第1、3、5、7天抽取3 個樣品，進行含菌量測定。根據CNAS-GL003[19]中|x-y|≤0.3σ準則對結果進行穩定性評價。EAEC gDNA標準物質模擬實驗周期為14 d，分別于第1、3、5、7、14天抽取3 個樣品，對特征性基因進行PCR擴增，考察樣品的運輸穩定性。

1.3.6.2 貯藏穩定性

將制備的EAEC菌體標準物質及gDNA標準物質分別于-20 ℃和4 ℃條件下保存2 個月。于4 ℃保存7、14 d和28 d，-20 ℃保存28 d和60 d，分別抽取3 個樣品進行菌含量測定，于4 ℃和-20 ℃保存28、45 d和60 d分別抽取3 個樣品進行特征性基因檢測，考察樣品的貯藏穩定性。根據CNAS-GL003[19]中|x-y|≤0.3σ準則對EAEC標準物質進行穩定性評價。

1.3.7 標準物質的協作驗證

使用上述制備好的樣品，按照國家藥品標準物質協作標定實施細則，發給3 家實驗室，代碼分別為A、B和C，每家實驗室收到10 件樣品，參照協作驗證作業指導書對樣品中EAEC標準物質及其gDNA標準物質進行檢驗，包括菌落計數和特征性基因檢測。

1.3.8 標準物質使用效果驗證

根據GB 29921—2013《食品中致病菌限量》[20]，選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5 種食品基質共20 份樣品對EAEC標準物質的使用效果進行驗證，樣品信息見表1。先將EAEC 103CFU濃度的標準物質溶于1 mL生理鹽水中，每件樣品各稱取2 份，25 g/份，1 份正常檢驗，1 份加入標準物質生理鹽水溶解溶液100 μL，根據GB 4789.6—2016[14]進行操作。增菌后劃線分離平板觀察是否有典型菌落生長，并進行PCR確認。

表1 食品樣品信息Table 1 Information about food samples used in this study

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用Nano Drop2000對提取的CMCC 44841基因組DNA進行純度測定，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm分別為1.70和2.37。利用Qubit熒光計測定EAEC DNA質量濃度為65 ng/μL，提取的DNA的質量濃度滿足全基因組測序和標準物質制備要求。

2.2 全基因組測序分析結果

利用二代高通量全基因組測序技術對CMCC 44841進行序列測定。獲得的基因組序列信息結果通過生物信息學分析，CMCC44841基因組大小為5.057 285 Mb，其N50重疊大小為114 319 bp，共有121 個長度從305 600 bp到505 bp不等的拼接序列，GC含量為50.6%，編碼區基因5 173 個。利用CGE網站KmerFinder對細菌進行種屬鑒定，結果顯示CMCC 44841鑒定為大腸埃希氏菌（E.coli），具體鑒定結果如表2所示。同時CGE網站分析CMCC 44841血清預測結果為O127:H21，MLST為ST40型。PATRIC和CGE毒力基因分析顯示，CMCC44841攜帶aggR、astA、pic毒力基因外，還預測到含有aap、aar、afaD、agg3C、lpfA、ompT等毒力基因，詳見表3。CMCC 44841全基因組測序數據已上傳至NCBI數據庫，序列號為SRR12278211。

表2 利用KmerFinder對CMCC 44841菌種屬鑒定結果Table 2 Identification of CMCC 44841 with KmerFinder

表3 利用VirulenceFinder對CMCC 44841毒力基因預測結果Table 3 Virulence gene prediction of CMCC 44841 using CGE

2.3 特征性基因PCR擴增結果

按照GB 4789.6—2016[14]的方法對CMCC 44841分別進行astA、aggR、pic特征性基因檢測。PCR擴增結果顯示，提取的CMCC 44841 DNA分別擴增出102、400 bp和1 111 bp長度片段。不同濃度DNA擴增結果如圖1所示，0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA均有特征性基因擴增產物，選擇CMCC 44841 DNA凍干小球標準物質使用時PCR的模板量不小于0.1 ng/μL，按照20 ng/球進行DNA標準物質的制備。

圖1 不同濃度DNA astA、aggR和pic基因PCR產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR and pic at different concentrations

2.4 標準物質的均勻性檢驗結果

隨機抽取的20 瓶EAEC菌體標準物質進行平板計數結果如表4所示，所有樣品菌落數均在103CFU數量級，數值符合正態分布。單因素方差分析結果顯示，制備的EAEC菌體標準物質組內和組間無顯著性差異，即樣品符合均勻性要求（F＝1.59＜F臨界值＝2.137，P＞0.05）。

表4 EAEC菌體標準物質計數結果Table 4 Counting results of EAEC cell reference material

隨機抽取10 瓶EAEC gDNA標準物質，PCR產物電泳結果顯示，10 個gDNA標準物質的astA、aggR、pic基因均得到清晰的擴增條帶（圖2）。

圖2 gDNA標準物質均一性aggR基因（A）、astA基因（B）和pic基因（C）PCR產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products of aggR (A), astA (B) and pic (C) genes with uniformity in gDNA reference material

2.5 標準物質的穩定性檢測結果

2.5.1 運輸穩定性結果

將所制備的EAEC菌體標準物質分別存放于25 ℃和37 ℃條件下，于第1、3、5、7天各抽取3 個樣品，通過螺旋涂布進行菌落計數。如表5、6所示，EAEC菌體標準物質在25 ℃條件下保存7 d穩定性良好，在37 ℃環境下5 d內穩定情況良好，第7天活菌數量下降出現不穩定現象，但菌含量仍能維持在103CFU/樣品水平，即滿足定性樣品的要求。

表5 EAEC菌體標準物質模擬運輸條件25 ℃穩定性結果Table 5 Stability of EAEC cell reference material during simulated transportation at 25 ℃

表6 EAEC菌體標準物質模擬運輸條件37 ℃穩定性結果Table 6 Stability of EAEC cell reference material during simulated transportation at 37 ℃

對分別在25 ℃和37 ℃條件下存放14 d的3 個EAEC gDNA標準物質樣品進行特征性基因檢測，PCR產物電泳結果如圖3所示，astA、aggR、pic基因均能擴增出清晰的條帶。說明EAEC gDNA標準物質在25 ℃和37 ℃條件下保存14 d穩定性良好。

圖3 gDNA標準物質25 ℃和37 ℃保存14 d astA、aggR基因（A）和pic基因（B）PCR產物電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR (A) and pic (C) genes in gDNA reference materials stored at 25 or 37 ℃ for 14 d

上述數據表明，EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質在非高溫季節，可以常溫運輸，而在高溫季節可以采用泡沫箱加冰袋的方式進行低溫運輸。

2.5.2 貯藏穩定性結果

通過與第0天的數據進行比較，由表7可以看出，EAEC菌體標準物質在-20 ℃保存60 d復蘇率為100%，表明-20 ℃可以滿足穩定性要求。4 ℃條件下，保存14 d復蘇率為95.6%，28 d復蘇率為78.2%，樣品中菌含量仍保持在103CFU/樣品水平，樣品穩定，表明4 ℃可以作為短期貯藏條件。

表7 EAEC菌體標準物質貯藏穩定性實驗結果Table 7 Storage stability of EAEC cell reference material

對分別在-20 ℃和4 ℃條件下存放60 d的3 個EAEC gDNA標準物質樣品進行特征性基因檢測，PCR產物電泳結果如圖4所示，EAEC gDNA標準物質在-20 ℃和4 ℃條件下保存60 d均能對astA、aggR、pic基因擴增出特異性條帶。說明-20 ℃和4 ℃滿足gDNA標準物質的貯藏條件。

圖4 gDNA標準物質－20 ℃和4 ℃保存60 d astA、aggR基因（A）和pic基因（B）PCR產物電泳結果Fig.4 Electrophoresis results of PCR products of astA, aggR (A) and pic (B) genes in gDNA reference materials stored at ?20 or 4 ℃ for 60 days

2.6 協作驗證結果

EAEC標準物質通過3 家協作驗證實驗室的標定，測定結果如表8所示，EAEC菌體標準樣品菌含量均為103CFU/樣品，與研制的目標值一致。生化和特征基因PCR鑒定結果符合EAEC的特征。同時EAEC gDNA標準物質特征基因PCR鑒定結果也符合實驗要求。

表8 EAEC協作標定結果Table 8 Results of collaborative interlaboratory calibration for EAEC cell reference material

2.7 標準物質使用效果驗證

選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5 種食品基質共20 份樣品對EAEC標準物質的使用效果進行驗證，檢驗結果顯示，20 件樣品正常檢驗（作為本底對照）分離平板上未見可疑菌落，而加入標準物質的樣品在分離平板上均有可疑菌落生長，并通過PCR檢測擴增得到相應的特征基因條帶，與gDNA標準物質擴增條帶大小一致。結果表明，研制的標準物質和基因組標準物質適用于食品中EAEC檢驗的質控需求。

3 討論和結論

準確快速的檢測技術是及時有效控制和預防由病原菌引起的食源性疾病的重要手段。目前食品和腹瀉病人中致瀉大腸埃希氏菌的檢測越來越受到關注和重視[21-23]。由于致瀉大腸埃希氏菌種類繁多的血清群/型，給檢驗工作帶來很多挑戰[24]。快速準確的檢驗工作不僅依賴于不同技術的檢驗方法，還需要科學使用標準物質保證實驗結果的準確性。目前，國內針對微生物標準物質的研制已有較大的發展，標準菌株多來自美國菌種保藏中心，而且對于標準菌株的鑒定方式多為傳統的生化反應[25-28]。目前對于具有我國自主知識產權而且具有清晰全基因組序列信息的標準物質研究還是空白。本研究采用EAEC標準菌株來源于中國醫學細菌保藏管理中心，分離自我國腹瀉病人，具有我國自主知識產權。

全基因組測序技術在微生物領域研究中發揮著越來越重要的作用[29-30]。隨著測序技術所獲得數據量的突破性進展，測序速度和費用得到大幅度改觀[31]。而且二代測序數據分析軟件的日趨完善，非生物信息學專業人員可以使用網頁類型分析工具對微生物基因組測序數據完成微生物遺傳特征、溯源等信息分析。Rapid Annotation using Subsystem Technology（RAST，http://rast.nmpdr.org）[32]能夠快速注釋基因組信息、CGE（https://cge.cbs.dtu.dk/）網站擁有方便快捷的獨立數據分析工具，可以進行種屬鑒定、耐藥基因、毒力因子、質粒分型以及菌株分子分型等特征分析[33]。這些網頁類型分析工具可提供更為直觀的用戶界面和簡便的操作環境[34]。本研究利用RAST、PATRIC、CGE對EAEC進行了種屬鑒定、血清分型和除astA、aggR、pic特征基因之外的毒力基因分析，為標準物質的研制提供科學依據。

本研究根據GB 4789.6—2016中的引物序列對EAEC標準物質進行了特征性基因擴增。實驗結果顯示，astA、aggR和pic基因得到清晰的擴增條帶，說明PCR擴增結果和全基因組測序數據結果準確對應。在傳統的生化方法基礎上，利用PCR技術對毒力基因進行擴增，是提高EAEC檢出率的有力手段[35]，同時也為標準物質的檢驗提供了快速準確的方法。

目前研究中報道的相關標準物質包括DNA標準物質是以粉末形式凍干[36]，本研究制備的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質均以小球的形式進行凍干，相比較粉末形式凍干，該標準物質使用避免了由于粉末開蓋帶來的污染和質粒污染，并且省去離心步驟，操作更加方便，同時該標準物質易于溶解，計數更準確。

本研究制備的EAEC菌體標準物質均勻性良好，經單因素方差分析符合標準物質的要求。經過25、37 ℃運輸穩定性測試，7 d仍能保持樣品中菌含量在103CFU/樣品水平，可以保證樣品在非極端的高溫天氣下運輸不受影響，而且在-20 ℃條件下可以長期貯存。對于EAEC gDNA標準物質，同樣具有很好的穩定性。考慮到食品基質的復雜性，本研究選用5 種不同的食品基質對標準物質進行驗證，結果顯示加入標準物質的樣品均能檢測到EAEC，說明研制的菌體標準物質和gDNA標準物質適用于食品中EAEC的檢驗，滿足質控要求。

綜上所述，EAEC是造成人體中重度腹瀉的重要病原菌之一，開展食品中EAEC檢測工作對維護人類健康意義重大。本研究研制的具有自主知識產權和全基因組數據的EAEC菌體標準物質和gDNA標準物質均勻性和穩定性良好，可用于實驗室質量控制及實驗室間比對，為EAEC的檢驗工作提供了有效參考手段，從而保證檢測結果的準確性和有效性。