濃香型白酒新、老窖池分層池底窖泥菌群總氫代謝與乳酸含量之間的關系

孟雅靜，王艷麗，丁 峰，李安軍，劉國英，何宏魁，張會敏*，王 錄，周慶伍，梁金輝，胡心行，張光耀

（安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236820）

窖泥對濃香型白酒的發酵具有重要作用，一般認為，窖泥越老，酒質越好[1]。新、老窖泥的質量差異，主要表現在菌群組成和理化性質的差異。窖泥菌群組成方面，與新窖泥相比，老窖泥中更豐富的菌屬組成形成了完整的窖泥菌群代謝網絡。老窖泥中含量更大的瘤胃菌（Ruminococcaceae）[2]和梭菌（Clostridium）[3]可以降解乳酸生成己酸、丁酸、乙酸和氫氣等；沉積菌屬（Sedimentibacter）[4]和胺桿菌屬（Aminobacterium）[5]可以降解氨基酸生成乙酸和丁酸等；互營單胞菌屬（Syntrophomonas）[6]可以降解C4～C8的脂肪酸形成乙酸、丙酸和氫氣等。以上氫氣產生菌可以與氫營養型甲烷菌共生轉化氫氣生成甲烷[7]，形成完整的窖泥菌群代謝鏈。甲烷菌是窖泥老熟的標志。窖泥菌群代謝鏈可以將乳酸等有機酸降解生成氫氣、甲烷等含氫氣體釋放。在理化性質方面，與新窖泥相比，老窖泥的乳酸含量遠小于新窖泥[8]。窖泥老熟過程中，其菌群組成與理化性質相互適應相互影響，老窖泥中乳酸含量的減少與菌群總氫代謝功能之間的關系是一個值得探討的問題。

窖泥菌群的功能主要在于產生濃香型白酒的各種風味物質。已知窖泥pH值對窖泥質量影響很大，Tao Yong等[1]研究發現窖泥pH值越接近中性，窖齡越老。優質窖泥pH值偏中性，而新窖泥和退化窖泥pH值偏酸性。窖泥pH值受其中各種有機酸含量的影響，已知乳酸是窖泥中含量最大的有機酸[8]，且乳酸的pKa值最小（3.86），對窖泥的pH值影響最大，張會敏等[9]證實窖泥中乳酸與pH值的相關性很強。因此，乳酸對窖泥質量具有重要影響。分析新、老窖泥中總氫相對含量差異，及其與pH值和乳酸之間的關系，有利于分析窖泥菌群代謝與窖泥質量之間的關系。

本研究分別選取安徽省北部某著名濃香型白酒公司的新、老窖池，進行分層分位點池底窖泥取樣。分析新、老窖池分層池底窖泥總氫相對含量的變化規律、總氫與pH值及乳酸之間的線性關系，以及乳酸與菌群含量的線性關系，深入討論新、老窖泥總氫代謝與乳酸含量之間的關系，旨在為窖泥改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣本取自安徽北部某知名濃香型白酒企業。

乳酸標準品 美國Fluka公司；磷酸二氫鉀 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Acquity超高效液相色譜（配二極管陣列檢測器和HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm））美國Waters公司；vario EL cube有機元素分析儀 德國Elementar公司。

1.3 方法

1.3.1 分層分位點池底窖泥樣本采集

分別選取窖齡不同而發酵工藝相同的新窖池（窖齡6 a）和老窖池（窖齡≥50 a）各6 個，采用三位點四層取樣方法對池底窖泥取樣[10]。老窖泥樣本添加O前綴表示；新窖泥樣本添加Y前綴表示。如老窖池中心點1～3 cm的窖泥樣本表示為O_Cen_13。每個窖池12 個窖泥樣本，共144 個窖泥樣本。

1.3.2 pH值和乳酸含量檢測

將新鮮窖泥與去離子水按照1∶3（g/mL）混勻靜置后用pH計檢測窖泥pH值[11]。將新鮮窖泥與去離子水以1∶9（g/mL）混勻，0.22 μm濾膜過濾后，通過液相色譜儀檢測乳酸含量。進樣量1 μL，流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液，柱流速0.1 mL/min，檢測波長208 nm，柱溫箱30 ℃。共檢測了新、老窖池各6 個，總共12 個窖池的144 個窖泥樣本。

1.3.3 窖泥中氫元素的半定量分析

新鮮窖泥經風干粉碎過40 目篩后，用有機元素分析儀在CHNS模式下進行總氫的半定量分析，燃燒管溫度1 150 ℃，還原管溫度850 ℃。檢測新、老窖池各3 個，共6 個窖池的72 個窖泥樣本。

1.4 數據處理與統計學分析

Pearson相關性和線性回歸分析通過Origin 9實現。差異顯著性分析通過方差分析（ANOVA，SPSS 25.0）實現。優勢菌屬拷貝數是通過每個樣本中各優勢屬序列數占每個樣本總序列數的百分比，乘以每個樣本的菌群16S rDNA總拷貝數得到。其中伯克氏菌屬（Burkholderia）即為Silva數據庫注釋得到的Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia菌屬。

2 結果與分析

2.1 窖泥中的總氫相對含量及其與pH值之間的關系

新、老窖泥中總氫相對含量均隨窖泥深度的增加而降低（圖1）。老窖泥中的遞降幅度較大，尤其是從0～1 cm到1～3 cm，以及從1～3 cm到3～5 cm顯著降低（P＜0.05），從3～5 cm到5～7 cm不具有顯著差異（P＞0.05）。新窖泥的遞降幅度較小，除0～1 cm與5～7 cm，以及1～3 cm到3～5 cm有顯著差異（P＜0.05），其余各層彼此之間無顯著差異。新、老窖泥總氫的變化代表其中含氫成分的變化，已知窖泥中有Caproiciproducens、Syntrophomonas和Methanoculleus等產生含氫氣體的菌[8]，這些菌群在新、老窖泥中的豐度不同[1]，因此推測新、老窖泥中總氫相對含量變化的差異可能與新、老窖泥中菌群代謝釋放氫氣和甲烷等含氫氣體的強度不同有關。

圖1 新、老窖池分層池底窖泥中總氫相對含量Fig.1 Relative contents of total hydrogen in young and old BPMs

新、老窖泥總氫相對含量與pH值的Pearson相關性分析（圖2）顯示，兩者的Pearson相關系數均呈較強負相關（-0.598 5和-0.865 7），表明新、老窖泥的總氫相對含量隨pH值的升高而降低。而兩者的回歸分析顯示：老窖泥總氫相對含量與pH值的線性回歸的擬合度更高（R2=0.745 8），指數回歸略有提高（R2=0.750 0）；新窖泥總氫相對含量與pH值的擬合度較低（R2=0.349 0），三項式回歸略有提高（R2=0.365 9）。表明窖泥總氫相對含量的降低（含氫氣體的釋放）與pH值的升高有很強的聯系，且直線回歸與非直線回歸相比（圖2），新、老窖泥的非直線回歸相對擬合度更高（R2值略有增大），且老窖泥中的擬合度高于新窖泥。其次，新、老窖泥的直線回歸顯示其總氫相對含量隨pH值增加均勻遞降（圖2A），而老窖泥的非直線回歸顯示其總氫相對含量隨pH值增加而遞降的幅度增加，尤其是在pH 8.0～9.5范圍內總氫相對含量下降最快；新窖泥的非直線回歸顯示其總氫相對含量隨pH值增加而遞降的幅度遞減，其遞降幅度主要集中在pH 4.0～7.0之間，pH 7.0之后遞降幅度基本不變（圖2B）。

圖2 新、老窖池分層池底窖泥總氫與pH值之間的直線回歸（A）與非直線回歸（B）分析（基于72 個新/老窖泥樣本）Fig.2 Linear and non-linear regression curves between total hydrogen and pH of young and old BPMs (based on 72 young/old BPM samples)

窖泥pH值與窖泥質量直接相關[1,11-15]，窖泥pH值的升高伴隨著窖泥總氫的減少（圖2），推測窖泥pH值升高所伴隨的酸降解與產氫氣菌和產甲烷菌的代謝產生含氫氣體有關。已知窖泥中乳酸是含量最大的有機酸，窖泥pH值的升高與其中乳酸的降解有關[8]。所以推測窖泥中乳酸降解和氫氣、甲烷等含氫氣體的釋放，使得窖泥中總氫相對含量降低。新、老窖泥樣本的pH值（4.33±0.24和5.08±0.32）[8]差異與其中相關菌群降解乳酸并產生含氫氣體的強度有直接關系。Van Ginkel等[16]指出活性污泥菌代謝產生氫氣的最適宜pH值為5.5，表層老窖泥的pH值（5.87±0.73）[10]正適合氫氣產生，0～1 cm到1～3 cm總氫減少幅度最大，表明0～3 cm老窖泥氫氣釋放量最大。老窖泥豐富的氫氣產生菌，如產己酸菌（Caproiciproducens）[17-18]、梭菌（Clostridium）[3]和胺桿菌屬（Aminobacterium）[5]，產生氫氣達到一定濃度時，與之共生的氫營養型甲烷菌的氫轉移作用[19]轉化氫氣形成甲烷[7]。甲烷菌傾向于在偏堿性環境中生存，當環境pH值從中性上升到9.0的弱堿性環境時，氫氣產生速率逐漸增大[20]，甲烷菌的氫轉移作用解除氫抑制，進一步促進氫氣產生，因此老窖泥在pH值8.5～9.5范圍內更適宜氫氣產生（圖2B）。不同于老窖泥，新窖泥pH值集中在4.0～7.0，在7.0～9.0內樣本的總氫隨pH值增加而降低的程度（斜率）反而減小，接近于0。分析其原因，可能與新窖泥菌群豐度比老窖泥低幾個數量級[21]，以及沒有形成完整的菌群代謝鏈[1]有關。一方面，可能豐度較低的新窖泥菌群代謝生成的氫氣濃度較低，無法提供甲烷菌生存的條件；另一方面，甲烷菌的繁殖速度很慢[22]，需要較長的時間才可以達到解除氫抑制所需要的代謝強度。因此新窖泥可能在后期pH 7.0～9.0范圍內處于氫抑制作用下無法繼續產氫。

2.2 窖泥中的總氫相對含量與乳酸之間的關系

如圖3所示，新、老窖泥總氫與乳酸的Pearson相關系數（0.600 7和0.719 2）表明，新、老窖泥的總氫相對含量隨乳酸含量的增加而增加，換言之新、老窖泥的總氫相對含量隨乳酸含量的減少而減少。為了驗證窖泥中總氫相對含量與乳酸含量之間的統計學關系，進一步建立兩者之間的線性回歸分析，圖3顯示：窖泥總氫相對含量與乳酸含量呈較強的線性關系。新、老窖泥相比，老窖泥中兩者直線回歸的擬合度較強（R2=0.510 3），新窖泥中的擬合度較弱（R2=0.351 7）。新、老窖泥中的總氫相對含量隨乳酸含量的減少而減少，推測新、老窖泥中總氫相對含量的減少與乳酸的降解有關，與已有結論一致[8]。與新窖泥斜率（5.101×10-5）相比，老窖泥中總氫相對含量與乳酸含量的直線回歸斜率更大（0.001），且新窖泥中乳酸含量遠高于老窖泥，表明老窖泥總氫相對含量隨乳酸含量減少的幅度遠大于新窖泥中的幅度。窖泥中乳酸絕對量受3 方面影響：黃水中乳酸的浸入量、窖泥菌群產生的乳酸量、窖泥菌群降解的乳酸量，其中前兩者為增量，后者為減量。與新、老窖泥中的乳酸含量（28.8 g/kg和10.72 g/kg）[9]相比，新、老窖池黃水中乳酸質量濃度高達80 g/L，且新、老窖池的黃水乳酸含量之間沒有顯著差異[23]，推測黃水浸入的乳酸含量對窖泥中乳酸增量起決定作用。新、老窖泥中乳酸的減少主要都是乳酸被降解的原因所致。新、老窖泥相比，老窖泥樣本較集中，新窖泥樣本較分散，推測老窖泥中菌群組成與理化性質比較均勻，而新窖泥的理化性質與菌群組成的均一度較差。已知窖泥中含有降解乳酸生成氫氣的菌[24]和產生甲烷的菌，能夠協同互助利用氫氣產生甲烷而解除氫抑制，如Ruminococcaceae[2]、Clostridium[3]、Methanoculleus[11]這些菌在窖泥中均為優勢菌屬，且在老窖泥中的含量高于新窖泥[8]。因此推測老窖泥中降解乳酸并產生含氫氣體的菌的豐度比新窖泥大。

圖3 新、老窖池分層池底窖泥乳酸含量與總氫之間的線性回歸分析Fig.3 Linear regression curve between lactic acid and total hydrogen of young and old BPMs

2.3 新、老窖池分層池底窖泥中優勢菌屬的拷貝數

為進一步驗證新、老窖泥中乳酸降解菌的豐度與乳酸之間的相關性，有必要首先分析其中所有優勢菌屬的豐度。本研究借鑒新、老窖池分層池底窖泥中16S rDNA V4區高通量測序數據（SRR8985614～SRR8985757），將可操作分類單元列表和其實時聚合酶鏈式反應絕對定量的16S rDNA V4區總拷貝數相結合，計算出各組窖泥樣本中優勢菌屬（相對豐度＞2%）[10]的拷貝數如圖4所示。Aminobacterium（3.56×103copies/g和3.67×107copies/g）和Fastidiosipila（3.94×103copies/g和2.75×107copies/g）是新、老窖泥中含量差異最顯著的菌屬，且主要存在于老窖池的1～7 cm中。本研究結果顯示老窖池分層池底窖泥中各優勢菌屬拷貝數普遍高于新窖池分層池底窖泥。老窖池各分層池底窖泥中的優勢菌屬含量比較接近，推測與老窖泥的均一性較好有關，可能老窖泥經過多年發酵馴化已達到老熟狀態，其菌群變化已趨于穩定，其理化環境更適合這些優勢菌屬的生長。新窖池分層池底窖泥中的優勢菌屬含量略有差異，推測新窖泥的均一性較差，新窖池窖泥的理化環境相對較差，如pH值偏低、乳酸含量偏高[1]等，不利于各優勢菌屬的生長，因此新窖池各分層池底窖泥中的優勢菌屬的含量不均衡。

圖4 新、老窖池分層池底窖泥中優勢菌屬拷貝數Fig.4 Absolute copy numbers of dominant genera in different layers of young and old BPMs

2.4 窖泥中的乳酸含量與窖泥優勢菌屬之間的關系

鑒于新、老窖泥的乳酸含量差異與菌群豐度差異有關，因此有必要建立兩者之間的關系，確認兩者之間的相關性。老窖池分層池底窖泥的乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數的Pearson相關系數為0.025 6，表明在老窖泥中兩者基本沒有相關性，可能是老窖泥的菌群已經成熟，代謝功能比較完善，且各分層池底窖泥的菌屬含量變化范圍較小，乳酸含量已經不會對它造成威脅。而在新窖泥中兩者呈很強的負相關（-0.665 2），表明新窖泥中乳酸含量隨窖泥優勢菌屬總拷貝數的增加而減少。為了驗證這個關系，建立新窖池分層池底窖泥乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數之間的回歸分析（圖5）。發現新窖泥的乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數呈線性關系，擬合度適中（R2=0.430 4），乳酸含量隨優勢菌屬總拷貝數的增加而減少，表明降解乳酸是新窖泥菌群很重要的一項代謝機能，推測新窖泥中大量乳酸的存在影響其菌群生存，因此新窖泥菌群集中于降解乳酸的代謝機能。

圖5 新、老窖池分層池底窖泥乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數之間的關系Fig.5 Relationship between lactic acid content and total copy number of dominant genera in young and old BPMs

鑒于新、老窖泥中乳酸含量與優勢菌屬豐度差異有關，以及兩者在新、老窖泥中的相關性不同，分別給出新、老窖池分層池底窖泥中21 個優勢屬的拷貝數與乳酸含量之間的Pearson相關系數（圖6），發現新窖泥中與乳酸含量相關性較強（＞0.5）的優勢菌屬有15 個，均與乳酸含量呈負相關；而老窖泥優勢菌屬拷貝數與乳酸的相關系數值正負參半，且相關性較強（＞0.5）的菌屬較少，只有Caproiciproducens和Hydrogenispora。新、老窖泥菌群優勢菌屬拷貝數與乳酸含量的相關系數進一步表明新窖泥中的大部分菌屬都處在降解乳酸的狀態，而老窖泥中已經沒有降解乳酸的壓力。

圖6 新（A）、老（B）窖池分層池底窖泥中21 個優勢屬拷貝數與乳酸含量的Pearson相關系數Fig.6 Pearson correlation coefficients between total copy numbers of 21 dominant genera and lactic acid of young and old BPMs

將新窖泥（圖6A）中與乳酸含量相關性強度大于0.5的15 個優勢菌屬總拷貝數和乳酸含量計算Pearson相關系數（-0.743 6），發現新窖泥中這15 個優勢屬總拷貝數與乳酸的相關性高于新窖泥菌群（-0.665 2）（圖5）。表明這15 個菌屬在參與降解新窖泥的乳酸過程中發揮重要作用。為驗證此結論建立線性回歸分析（圖7），發現新窖泥中這15 個優勢屬總拷貝數與乳酸含量線性回歸的擬合度（R2=0.546）高于新窖泥菌群（R2=0.430 4），證實是這15 個菌屬共同參與新窖泥中乳酸的降解。已知，Caldicoprobacter和Sedimentibacter具有降解乳酸的功能[24]，盡管其余菌沒有直接參與降解乳酸，但它們彼此之間的協同作用[25]形成代謝網絡，為降解乳酸服務，而非每種菌屬均有降解乳酸的功能。比如Caproiciproducens可以代謝產生H2、乙醇、乙酸、丁酸和己酸[26-27]，Fermentimonas和Proteiniphilum能夠產生乙酸、丙酸和H2[28]，Hydrogenispora[29]可產生醋酸鹽、乙醇和H2，Garciella[30]和Caldicoprobacter[31]發酵產H2、CO2、乳酸鹽、乙酸鹽，Caloribacterium發酵產生醋酸鹽、H2、CO2[32]，Syntrophomona與甲烷菌共培養，可以降解C4～C8的中長鏈脂肪酸（如己酸和丁酸等）產生乙酸、丙酸和H2[33-34]。上述產氣菌產生的H2、CO2和乙酸可以作為Methanoculleus[22,35]（氫營養型甲烷菌）的底物產生甲烷。含氫氣體（H2、CH4）的釋放，不僅降低窖泥總氫相對含量，使窖泥pH值升高，又優化窖泥的厭氧環境，有利于乳酸降解菌的生長代謝。

圖7 新窖池分層池底窖泥中15 個優勢屬（Pearson相關系數絕對值＞0.5）總拷貝數與乳酸之間的線性回歸分析Fig.7 Linear regression analysis of total copy number of 15 dominant genera (absolute value of Pearson coefficient > 0.5) and lactic acid in different layers of young BPMs

以上菌屬所形成的代謝網絡，其降解乳酸的功能與產氫氣、甲烷等直接相關，而窖泥中的乳酸降解產氫菌[2-3]甲烷菌協作降解乳酸，產生弱酸，并釋放氫氣與甲烷等含氫氣體，減少窖泥總氫的同時提高窖泥pH值和解除產氫菌受氫抑制作用。新、老窖泥相比，老窖泥菌群的代謝網絡相對更完整，新窖泥中甲烷菌（如Methanoculleus）的豐度更少，而甲烷菌是解除“氫抑制”的終端，但是甲烷菌的繁殖速度很慢，如Methanoculleus的生長速率為2.5～35 h/代[22]。因此新窖泥需要很多年才能老熟，使其菌屬代謝網絡完整。

綜上，老窖池由于已經達到老熟，各分層池底窖泥中菌群代謝功能的重點已經不在降解乳酸上；而新窖泥還在不斷進化中，各分層池底窖泥的菌群功能不夠成熟，面對的生存壓力主要是乳酸對其影響。乳酸不僅對窖泥pH值影響很大，還具有一定的抑菌功能[36-37]，因此新窖泥中菌群為了生長繁殖，整體功能都在于降解乳酸，改善窖泥的理化環境。

3 結 論

本研究通過分析新、老窖池分層池底窖泥總氫代謝與乳酸含量之間的關系，得出結論：1）新、老窖池分層池底窖泥中總氫相對含量均隨窖泥深度的增加而降低，且老窖泥的遞降幅度較大，呈顯著降低趨勢，新窖泥之間總氫變化不顯著；新、老窖泥總氫相對含量隨窖泥的pH值升高而降低，且老窖泥的遞降幅度大于新窖泥；新窖泥總氫相對含量在pH 7.0之后遞降幅度趨于平緩，而老窖泥的遞降幅度增大。2）新窖泥中乳酸含量遠大于老窖泥，新、老窖泥總氫相對含量隨乳酸含量的減少而減少，與新窖泥（5.101×10-5）相比老窖泥的直線回歸斜率更大（0.001），表明老窖泥總氫相對含量隨乳酸含量減少的幅度遠大于新窖泥。3）老窖池分層池底窖泥中的優勢菌屬總拷貝數普遍高于新窖池；老窖池各分層池底窖泥的優勢菌屬含量分布更均勻，新窖池各分層池底窖泥的優勢菌屬含量略有差異。4）老窖泥的乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數之間基本沒有相關性（0.025 6），新窖泥乳酸含量與優勢菌屬總拷貝數有較強的負相關（-0.665 2）。新窖泥中與乳酸含量相關性較強（＞0.5）的優勢菌屬有15 個，均與乳酸含量呈負相關；而老窖泥優勢菌屬與乳酸的相關系數值正負參半，與乳酸含量相關性較強（＞0.5）的優勢菌屬只有Caproiciproducens和Hydrogenispora。可能新窖泥中大部分菌屬都處在降解乳酸的狀態，而老窖泥中已經沒有降解乳酸的壓力。5）新窖泥中相關性較強的15 個優勢屬總拷貝數與乳酸含量的回歸擬合度（R2=0.546 0）和相關性（-0.743 6）均高于新窖泥菌群的回歸擬合度（R2=0.430 4）和相關性（-0.665 2），可能是這15 個菌屬在共同參與新窖泥的乳酸降解過程中發揮重要作用。

綜上，推測老窖泥的菌群代謝鏈比較完整，各分層池底窖泥的菌屬含量相對穩定，而新窖泥的菌群還在進化中，代謝鏈不夠完善。因此老窖泥中氫代謝及酸降解速度均比新窖泥快，推測降解乳酸已經不是老窖泥菌群代謝的主要壓力。新窖泥還沒達到老熟狀態，優勢菌屬相對較少，所以乳酸大量存在可能對新窖泥菌群的生長影響很大，推測新窖泥的大部分菌屬都參與降解乳酸及氫代謝，才能緩解和改善窖泥的理化環境。