快速現場評估（ROSE）在胸部腫瘤氣管鏡介入診斷中的應用價值

王麗偉 李銀 萬良紅 黃云超 譚慧 胡早秀 黃秋博 田民

常規支氣管鏡、3D磁導航支氣管鏡、支氣管鏡針吸活檢（transbronchial needle aspiration，TBNA）、超聲支氣管鏡引導經支氣管鏡針吸活檢（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）等支氣管介入活檢在胸部腫瘤的診斷和分期中意義重大，是肺癌、縱隔原發及癌性轉移病變等疾病的重要檢查手段[1-3]。但支氣管內鏡介入下獲取的診斷標本，僅靠床旁肉眼觀察及經驗判斷，其質量不能達到病理診斷的要求，從而直接影響病理確診率。

胸部腫瘤的快速現場評估（rapid on-site evaluation，ROSE）技術由意大利錫耶納大學Giuseppe Marciano教授首創，是指在操作現場對取得組織標本進行即時制片和染色，通過顯微鏡快速初步診斷，指導進一步操作的技術[4]。ROSE技術運用于活檢中，可縮短操作時間、降低操作風險、提高診斷陽性率[4-5]。在胸部診療中的運用能有效降低部分患者因沒有取到理想診斷標本不能獲得病理學診斷，而不得不接受重復支氣管內鏡介入檢查，甚至接受胸腔鏡、縱膈鏡、開胸活檢等創傷性較大的手術的幾率。

2019年10月—2020年10月，由云南省腫瘤醫院胸外一科、病理科、超聲醫學科、麻醉科、檢驗科與血管外科（介入組）成員組成的胸部腫瘤支氣管介入ROSE診斷小組，按照ROSE標準操作流程完成了635例患者胸部腫瘤患者支氣管介入活檢，現將結果報道如下。

資料與方法

一、研究對象

2019年10月—2020年10月于云南省腫瘤醫院行常規支氣管、TBNA和EBUS-TBNA聯合ROSE評估患者共計635例。全部患者均為電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或正電子發射計算機斷層顯像/CT確認存在肺部占位性病變、至少有1組縱隔或肺門淋巴結腫大（淋巴結短徑大于10 mm）。檢查前需常規行血常規、肝腎功能、凝血功能等相關檢查，確認無相關禁忌。根據術前病情判斷需行TBNA或EBUS-TBNA檢查的患者，需完善胸部增強CT檢查，部分患者需行支氣管三維重建。

二、支氣管介入診斷操作流程

首先根據患者CT影像學表現及病史，選擇檢查方式：常規支氣管鏡、TBNA或EBUS-TBNA檢查以及是否需加做病原菌現場評估。常規支氣管鏡（BF-260F，Olympus，日本）檢查在局麻下進行腫物的取材活檢、刷檢及灌洗，每次組織或細胞取出時即刻行快速現場評估。若ROSE評估結果為陽性，則結束操作；若取材樣本不滿意，則立即行TBNA，穿刺針型號122（Conmed Corprotion，美國），以最易穿刺的氣管內腫物或7組、4組淋巴結為優先穿刺目標，評估結果為陽性操作結束，陰性則在原部位或另選點穿刺，每個部位穿刺數不超過7 次。EBUS-TBNA（BF-UC260FW，Olympus，日本）操作在全麻下進行，選用21G穿刺針（NA-201SX-4021，Olympus，日本），穿刺淋巴結定位采用WANG氏分區法定位。每針穿刺后即行ROSE評估，結果陽性，結束操作；陰性則換點穿刺，保證單組淋巴結獲取2～3個樣本，每個樣本2～3張涂片。若患者身體條件不允許或者多次、多途徑取材均未獲得陽性標本，則停止氣管鏡操作。

常規支氣管鏡與部分TBNA在局麻下完成：患者術前空腹6 h以上行2%利多卡因進行鼻咽部噴霧麻醉后進入主氣管，再分兩次予以2%利多卡因10 mL行表面麻醉。EBUS-TBNA與部分TBNA采用無痛靜脈麻醉，患者保持自主呼吸，面罩通氣，肺功能較差患者可在喉罩輔助呼吸下完成。操作全程行心電、血壓、指脈氧監測，氧氣吸入。

術中出血量大于5 mL患者，可對出血點直噴1∶10 000去甲腎上腺素鹽水、凝血酶或采用氣管鏡頭端壓迫止血，術后常規予云南白藥膠囊口服止血。

三、ROSE流程

制片：在氣管鏡檢查進行過程中，若為樣本成型則制作印片，垂直或稍傾斜均勻用力印于載玻片上；若為液體則制作涂片，螺旋向外鋪開，避免細胞過多重疊；灌洗液吸出后立即用單層紗布濾除黏液，用吸管吸取10 mL至離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液震蕩15～20 s后，做細胞涂片吹干觀察。每次制作2～3張玻片，其中1張在95%乙醇溶液中固定3～5 min后聯合活檢標本一同送檢病理科。

染色：應用浸染法行迪夫快速細胞染色液（Diff-Quik cell stain）染色，操作如下：（1）先將1～2片浸泡于迪夫A溶液中約5～10 s；（2）將制片于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液的染缸中洗滌5 s；（3）輕甩干后再將制片浸泡于迪夫B 溶液中5～10 s；（4）在蒸餾水中水洗后干燥后即完成染色。

術前高度懷疑感染者或合并感染真菌感染者，同時行改良乳酸染色，懷疑球菌或桿菌感染行革蘭染色。

操作結束后涂片使用95%乙醇固定，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）送病理檢查?？芍谱骷毎瑐涿庖呓M化及基因檢測使用。

四、ROSE結果判讀

所有獲取的染色涂片由2位病理科醫師或檢驗醫師在光學顯微鏡下閱片，快速對其形態進行認定。涂片多個淋巴細胞團或較多癌細胞，認為穿刺成功（圖1、2）；大量紅細胞或有核細胞很少，則認為穿刺失?。▓D3、4）。發現癌細胞則認為穿刺結果陽性；未發現癌細胞，則認為穿刺結果陰性。每例患者任何一個部位ROSE結果陽性，則認為總結果陽性；全部部位ROSE結果陰性，則認為總結果陰性[6]。

圖1 細胞（10×20）呈大小不一腺樣結構，可見散在核仁（腺癌）

圖2 細胞（10×20）形態不規則，呈裸核拉絲樣改變（小細胞肺癌）

圖3 重疊細胞（10×20）多，結構不清，背景見散在分布血紅細胞

圖4 重疊細胞（10×20）重疊，結構模糊，背景見血紅細胞

根據不同的認定結果（包括確定惡性細胞、可疑惡性細胞、惡性細胞陰性；標本不滿意包括發現出血、壞死或黏液狀的物質等）來指導氣管鏡的進展程度：取得理想標本則停止操作；若不理想或者取材不準確則需調整取材部位或者取材方式繼續進行。

五、ROSE相關指標觀察

比較ROSE結果與最終的HE染色結果的一致性，統計ROSE樣本滿意度、每個淋巴結與支氣管腫物鉗夾和穿刺次數、取材成功率、并發癥發生率。胸部腫瘤支氣管介入活檢常見的并發癥包括出血、縱隔氣腫、氣胸等。出血量由支氣管鏡醫師根據鏡下表現估計：＜5 mL出血為極少量，5～20 mL為輕度，20～100 mL為中度，＞ 100 mL為重度，輕度及以上出血認為是并發癥[7]。對未確診患者后續診療及最終病理結果進行隨訪。

六、統計學分析

使用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。

結 果

一、患者一般資料、檢查及取材情況

全組635例患者中，男415例，女220例，年齡最大78歲，最小27歲，平均（52.4±13.2）歲；常規支氣管鏡330例，常規支氣管鏡中轉TBNA 12例，TBNA 30例，EBUS-TBNA 215例；腫瘤直徑為（3.3±1.4）cm，腫大淋巴結的短徑為（1.9±0.3）cm；取樣來自肺部腫物360例，淋巴結250例；取材方式：單純鉗夾215例，鉗夾+刷檢60例，刷檢+灌洗70例，灌洗+鉗夾、刷檢或穿刺60例，穿刺230例；送微生物培養加藥敏鑒定160例。

麻醉方式：局麻381例，靜脈全麻243例（其中11例為喉罩輔助呼吸）。

全組635例中70例為首次病理結果為可疑惡性、行二次檢查患者。

二、ROSE診斷率與HE染色結果

全組635例患者，取材滿意率93.7%（594/635）；確診為惡性腫瘤485例（其中肺癌395例、轉移性癌40例、淋巴瘤30例、其他20例），結核20例，結節病10例，感染105例（其中單純感染14例，腫瘤合并感染7例），陰性結果10例。

本研究中ROSE診斷結果與HE染色病理結果一致性93.7%（119/127）；惡性腫瘤的ROSE診斷與最終HE染色病理確診的符合率94.8%（92/97），未出現假陽性的結果，假陰性率2.4%（15/635）。確診惡性中ROSE結果與HE染色病理結合不一致者為25例：5 例為未找到腫瘤細胞，5例為可見可疑核異質細胞而未明確診斷，病理科醫師建議再次取材明確診斷，但均因患者身體狀況不允許或家屬不認可重復氣管鏡檢查而未得到確診；另外15例為ROSE診斷結果為陰性患者，在HE染色中確診為惡性，10例為腺癌，5例為鱗癌。

三、并發癥觀察及診療隨訪

全組肺部腫物共取材680部位，1 785次取材（鉗夾和穿刺），平均穿刺數（2.6±1.9）次，取材成功率89.3%（1 588/1 785）；縱隔淋巴結穿刺部位435部位，865針，平均穿刺數（2.0±0.4）次，穿刺成功率82.1%（710/865）；術后出現并發癥95例，發生率14.9%（95/635）：75例為氣道出血（輕度出血65例，中度10例）、15例惡性嘔吐（考慮為麻醉反應）、5例確診結核患者出現術后發熱，以上病例經對癥治療后恢復，未出現重度出血、氣胸、縱隔出血等并發癥。

25例影像學考慮為惡性可能患者，但ROSE結果與HE病理結果均為陰性，15例接受手術均確診為惡性，其中腺癌10例，轉移性癌5例；剩余10例定期隨訪中。

本組70例首次非ROSE檢查HE結果為可疑惡性，接受ROSE檢查評估最終55例確診為惡性，有效率78.5%（55/70），其余15例定期隨訪中。

討 論

近年來3D支氣管模擬電磁導航支氣管鏡、超聲氣管鏡廣泛運用于臨床，如何以最小創傷安全有效地獲得高質量的樣本，提供可靠的病理診斷以及為肺部靶向治療基因突變檢測提供足量的樣本，ROSE技術在胸部腫瘤支氣管介入活檢診斷中運用的需求越發迫切[8]。

ROSE在肺介入診療中的運用開展較早，20世紀90年代對ROSE技術的探索性研究結果提示：有細胞學家在場時標本含有腫瘤細胞的比例由31%提升至56%[9]；Austin等[10]對55例疑似肺癌患者行TBNA檢查，25例ROSE操作，其陽性率為100%。隨著細胞染色技術及支氣管活檢技術的發展，兩項評估ROSE技術對胸部CT表現為肺門/縱隔淋巴結腫大患者診斷價值的隨機對照研究結果提示：ROSE組診斷率為91.9%，非ROSE組78.1%，兩組診斷率無統計學差異[4,11]。

本研究中ROSE診斷結果與HE染色病理結果一致性為93.7%，與上述研究結果相似；但本研究未設置對照組，ROSE技術能否提高胸部腫瘤的診斷率還需大樣本、隨機對照研究進一步證實。本組資料中ROSE診斷出現15例假陰性，考慮可能為常規涂片只有1片HE染色發現惡性細胞，也可能是病理醫師在高強度工作下的遺漏，提示最終病理診斷需以HE染色結果為準。本組病例影像學高度懷疑惡性而ROSE結果與HE病理結果均陰性的25例患者中15例經手術確診為惡性，說明ROSE技術也有盲點，對于ROSE及HE染色均為陰性結果的高?；颊?，也可考慮進一步外科診療。

值得關注的是本組資料中70例為首次非ROSE指導檢查HE結果為可疑惡性，接受ROSE檢查最終55例確診，其效率高達78.4%。提示ROSE能有效降低胸部腫瘤患者二次支氣管活檢率。

研究表明取材次數越多，確診率越高，可根據取材部位和目的不同，選擇適當的取材次數，僅為明確診斷推薦為3次；若為明確肺癌分期則應穿刺4～5次，但穿刺7次后增加穿刺次數陽性率無明顯增加[12]；最近一篇系統性回顧研究中推薦為3～5次[13]。若需進一步行癌基因檢測指導治療，可適當增加取材次數。本組患者主要以明確診斷為主要，本組肺部腫物平均取材數（2.6±1.9）次，成功率89.3%；縱隔淋巴結平均穿刺數（2.0±0.4）次，成功率82.1%，優于非ROSE文獻報道中的平均穿刺數（3.7±1.6）次與（4.6±1.4）次。本組資料并發癥發生率14.9%高于其他行ROSE評估文獻報道，可能是其他文獻僅納入行TBNA 或EBUS-TBNA患者，而本組資料包括常規氣管鏡活檢患者資料，并統計了其他如麻醉等并發癥；同時本組資料并未發現因為穿刺針數減少，術后出血生率較非ROSE報道減少，這與Trisolini等[11]的研究結論相似。

對于胸部腫瘤經氣道取材活檢至少需要多少組織才能獲得足夠的穿刺樣本、應制備多少張涂片和切片以及穿刺針型號如何選擇，才能確保獲得足夠的樣本，目前無專家共識和循證醫學指南[14-16]，ROSE評估下的氣道取材標準更是空白[18-19]。本組經驗是使用21 G穿刺針，取2～3條活檢組織，即能制備足夠的涂片用于Diff-Quik、HE染色及免疫組化，多余的組織及細胞可用收集液采集制作成細胞塊以備相關癌基因檢測，經ROSE的質量評估，其檢測結果的代表性和可靠性更佳。本組研究中使用Diff-Quik染色，操作簡單，試劑便宜、染色時間短，靈敏度及特異性較高。亦有使用快速瑞氏-姬姆薩染色、快速巴氏染色及甲苯胺染色行ROSE報道[5-6,16]，但其操作流程相對復雜，在ROSE過程中往往需要技師的幫助，有一定限制性。

將ROSE技術應用于胸部腫瘤支氣管介入活檢診斷，需要有經驗的細胞病理學專家、超聲醫學科醫生、麻醉科醫生、胸外科醫生甚至包括微生物專家級熟練的護士或技師的完美配合，才能保證ROSE診斷及支氣管介入活檢流程高效、快速進行。醫學分工的細化，醫務人員工作繁重，缺乏同時掌握病理學、超聲醫學、麻醉學、微生物學及氣管操作的專業人員。我們的經驗是由胸外科、病理科、超聲醫學科、麻醉科、檢驗科、血管外科及相關護理人員組成胸部腫瘤支氣管介入ROSE診斷小組，通過組內1個月輪轉，以及開辦學習班即學即用開展胸部腫瘤ROSE診斷工作。2014年的一項研究[20]表明胸科醫師經過3個月的細胞病理學培訓后行ROSE檢查，準確率可達80%，與病理學家的準確率92%相比無統計學差異。我們可以相信未來胸部腫瘤ROSE診斷技術將會得到普及。

總之，ROSE技術運用于胸部腫瘤支氣管活檢診斷，不僅獲得樣本滿意度高、診斷結果與HE染色一致性高、取材成功率高，還可有效降低二次檢查率，而且操作簡便、安全可靠，臨床推廣價值巨大。

特別感謝意大利錫耶納大學Giuseppe Marciano教授的指導！