大鼠急性肺栓塞模型的建立及CD147表達水平對栓塞大鼠肺動脈壓力變化的影響

盧光東 賈振宇 張金星 趙林波 施海彬

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是一種嚴重危害人類健康的心血管急癥[1]。APE發生后，肺血管床的突然阻塞以及肺血管收縮造成肺血管阻力急劇升高，從而導致右心功能不全甚至右心衰竭[2]。因此，迅速降低肺血管阻力是改善APE患者預后的關鍵[3]。研究發現，炎癥反應在APE后的肺血管收縮中起重要作用[4]。肺動脈堵塞后，大量的中性粒細胞及巨噬細胞聚集并快速釋放和激活大量金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。激活的 MMPs通過促進血管收縮因子ET-1[5-6]、降鈣素基因相關肽[7]及腎上腺髓質素[8]等的產生引起肺血管收縮。但是，引起APE后肺組織炎性細胞聚集的機制尚不清楚。近來的研究發現，在缺氧、感染、氧化應激等條件刺激下，多種細胞表面的白細胞分化抗原CD147通過活化ERK1/2-NF-κB途徑促進炎性細胞聚集，從而加速了炎性反應的發生[9]。但其在APE后肺組織炎癥反應中是否起作用尚不清楚。因此，本研究擬以大鼠為實驗動物，通過介入技術建立一種制作簡單、可重復性高的APE動物模型，同時初步探討APE發生后肺組織中CD147表達水平變化對栓塞大鼠肺動脈壓力變化的影響。

資料與方法

一、研究對象

成年健康SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重300～320 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，飼養于南京醫科大學現代毒理學教育部重點實驗室動物中心（每籠5只）。實驗動物自由進食、進水，飼養室每隔12 h明暗交替，環境溫度為（22±2）℃，相對濕度為50%～60%。本實驗經南京醫科大學倫理委員會審核批準（倫理號：IACUC-1701004）。

二、制備方法及模型建立

（一）栓塞顆粒的制備

模型建立前30 min，精密電子天平稱量直徑約300 μm的Sephadex G-50葡聚糖微球（美國GE公司）80 mg置于5 mL離心管內，注入2 mL生理鹽水，震蕩，置于室溫備用。使用前再次手動震蕩以使顆粒充分懸浮。

（二）大鼠APE模型的建立

電子天平稱量大鼠質量，經腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉大鼠；將大鼠仰臥位固定，去除右側大腿內側面毛發并消毒；用手術刀沿股動靜脈走行方向在大鼠右側腹股溝區切開約1 cm小口暴露股動靜脈，右手持生理鹽水沖洗過的24 G靜脈留置針，在手術顯微鏡視野下直接穿刺股靜脈置鞘；針鞘置入后注入0.2 mL生理鹽水以檢測通路是否通暢，固定備用；用1 mL注射器經鞘管向股靜脈內緩慢注射之前制備好的栓塞顆粒（12 mg/kg），注射時應呈間歇脈沖式，過程持續約5 min，以防注射過快導致動物猝死。假手術組大鼠置鞘成功后僅注入0.8 mL生理鹽水；藥物注入結束后拔除針鞘并按壓3～5 min，絲線縫合右側腹股溝切口；將大鼠移至適宜的環境待其自由蘇醒。（本實驗已剔除中途死亡大鼠）

三、實驗動物分組及數據采集

實驗動物共分為4組，每組12只，具體為：假手術組（右側股靜脈置鞘，僅注射0.8 mL生理鹽水）；anti-CD147對照組[置鞘，先經股靜脈注射0.5 mL生理鹽水，后即刻將CD147單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，sc-46700）以 3 mg/kg的量注入]；APE組（置鞘，注入栓塞顆粒建立APE模型，5 min后再注入0.3 mL生理鹽水）；anti-CD147干預組（置鞘，注入栓塞顆粒建立APE模型，后即刻將CD147單克隆抗體以3 mg/kg的量注入）。每組中隨機選6只大鼠，右頸靜脈插管，用多通道生理記錄儀PowerLab 8/30測量其建模后5、10、20、30、40、50 以及 60 min 平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。余每組中另外6只大鼠測量其建模24 h后的mPAP，測壓結束后即刻處死大鼠，留取血漿及肺組織。血漿標本用于ELISA法檢測TNF-α和IL-6（ELISA試劑盒，江蘇菲亞生物科技有限公司）表達水平，右下肺組織用于測定髓過氧化物酶活性及CD147表達水平（Western blot），左下肺組織用于行病理學檢查。

四、統計學方法

采用 SPSS 24.0軟件行統計學分析，計數資料以率或構成比表示，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異行單因素方差分析，組間兩兩比較行Tukey檢驗，P＜0.05時認為差異有統計學意義。

結 果

一、模型制作情況

4組大鼠體重無明顯差異，所有大鼠均建模成功，技術成功率為100%。假手術組及anti-CD147對照組大鼠全部存活。APE組及anti-CD147干預組大鼠注入栓塞顆粒過程中出現口唇紫紺、呼吸急促，部分因呼吸心跳驟停而死亡，死亡率為22.6%（7/31）。假手術組大鼠肺組織外觀呈均一粉紅色（圖1A）；APE組大鼠的肺組織呈紅白相間地圖樣改變（圖1B），肺組織病理切片上可見肺動脈內有栓塞顆粒及血栓形成（圖1C）。

圖1 假手術組和APE組大鼠肺組織外觀

二、CD147單克隆抗體干預對栓塞大鼠mPAP的影響

假手術組及anti-CD147對照組間大鼠mPAP在建模后壓力無明顯差異且無明顯變化；APE組及 anti-CD147 干預組在建模后 5、10、20、30、40、50以及60 min mPAP均較假手術組明顯升高（P＜0.01），在建模40 min之內，兩組之間mPAP無明顯差異，在建模后50、60 min，anti-CD147干預組大鼠mPAP明顯低于APE組（P＜0.05），但仍較基線值明顯升高（圖2A）。建模24 h后，anti-CD147干預組大鼠mPAP仍明顯低于APE組（P＜0.01）（圖2B）。

圖2 各組大鼠建模后60 min內及24 h后mPAP的變化及比較

三、CD147單克隆抗體干預對栓塞大鼠肺組織中MPO活性及血漿中TNF-α、IL-6水平的影響

APE模型建立24 h后，與假手術組（圖3A）相比，APE組大鼠肺組織中明顯可見中性粒細胞聚集（圖3B），MPO活性明顯升高（P＜0.01，圖4A），血漿中TNF-α及IL-6水平亦明顯升高（P＜0.01，圖 4B、4C），而應用 CD147單克隆抗體干預后，肺栓塞大鼠肺組織中中性粒細胞聚集有所減輕（圖 3C），MPO 活性明顯下降（P＜0.01，圖 4A），血漿中TNF-α、IL-6水平亦明顯降低，基本恢復至基線水平（P ＞ 0.05，圖 4B、4C）。

圖3 APE建模24 h后各組大鼠肺組織病理切片（×400）

圖4 各組大鼠建模24 h后肺組織中髓過氧化物酶活性及血漿中TNF-α、IL-6水平的比較

四、CD147單克隆抗體干預對栓塞大鼠肺組織中CD147表達的影響

APE模型建立24 h后，通過Western blot檢測CD147單克隆抗體干預對肺組織中CD147表達的結果顯示（圖5A、5B），假手術組CD147呈低水平表達；APE組大鼠肺組織中CD147表達水平明顯升高（P＜0.01），而應用CD147單克隆抗體干預明顯降低了栓塞大鼠肺組織中CD147表達水平（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠肺組織中CD147表達水平的比較

討 論

既往國內外文獻中所報道的大鼠APE模型均是經頸靜脈注射栓子來建立，操作過程中需先分離頸靜脈再行穿刺置管。但大鼠頸部脂肪較厚且頸靜脈迂曲柔軟，頸靜脈的分離不僅費時且容易損傷，從而導致建模容易失敗。在本實驗模型建立過程中，我們采用介入技術，直接在手術顯微鏡下用24 G靜脈留置針穿刺相對平直的股靜脈來注射栓子，免去了分離靜脈的操作，使建模過程更加簡單，大大縮短了操作時間，提高了建模成功率。我們之所以用葡聚糖微球作為栓子來取代自體靜脈血，主要是考慮到兩個因素：首先，SD大鼠本身具有很強的內源性纖溶活性，能夠在24 h內將肺動脈內自體血栓溶解約95%[10]，很難模擬人類APE時肺動脈壓力在一段時間內的變化；其次，使用規格基本統一的微球顆粒作為栓子能使APE模型的建立更加簡單可控，減少大鼠的體重對模型的影響，避免各組大鼠間肺栓塞的程度存在較大的差異。注射進大鼠下腔靜脈內的葡聚糖微球堆積在肺動脈，短時間內使肺動脈阻力明顯增加，肺動脈壓力急劇上升[4,11]，這個過程很好地模擬了人類下肢深靜脈血栓脫落至肺動脈時所引起的血流動力學變化。

APE發生后，除了肺血管床的機械性阻塞，肺血管的收縮也被認為是引起肺動脈壓力升高的重要因素[12-14]。之前的研究證實APE后發生的肺血管收縮與炎癥反應密切相關，APE發生后，大量炎性細胞聚集到栓塞血管及肺組織周圍，快速釋放大量含MMPs的顆粒[15]，活化的中性粒細胞釋放的超氧化物聯合其他氧化應激因素激活MMPs[16]，激活的MMPs能夠通過將大ET-1裂解為ET-1或其他強有力的血管收縮劑來調節肺血管的收縮性[17-18]，還能通過表皮生長因子的轉錄激活等途徑來影響APE后的肺血管阻力[19]，引起或加重肺血管的收縮。相關實驗證明，應用MMPs的抑制劑多西環素能夠明顯降低APE動物模型中的肺動脈壓力[11,20]，但因其副作用及可能導致的并發癥，多西環素并未在臨床得到應用。因此，仍需進一步研究來明確APE后栓塞肺組織發生炎癥反應的具體機制，尋找其他關鍵作用因子，減輕APE后的炎癥反應，降低肺血管阻力。我們的研究結果表明，應用CD147單克隆抗體能夠顯著降低血漿中細胞因子TNF-α和IL-6的水平，減少栓塞大鼠肺組織中中性粒細胞的聚集，降低APE后的肺動脈壓力。基于以上結果及相關文獻，我們認為，APE發生后，CD147可能作為一個關鍵因子參與了APE后肺組織炎癥反應的發生及維持，進而參與了肺血管收縮這一病理過程。

本實驗結果中有兩點需要引起我們特別注意。首先，抑制CD147對mPAP的降低作用直到APE發生后50 min才開始比較顯著，而栓塞后前40 min，APE組大鼠與anti-CD147干預組大鼠的mPAP變化并無明顯差異。這說明APE發生后極早期的肺血管收縮更可能由5-HT[21]、TXA2[22-23]等其他血管收縮因子主導，而炎癥引起的肺血管收縮則在APE 50 min后開始占據主導地位。其次，盡管CD147單克隆抗體顯著降低了APE大鼠的mPAP，但干預組大鼠mPAP即使在栓塞后24 h仍明顯高于基線水平，這說明此部分升高的肺動脈壓力可能主要來自于肺血管床的機械性阻塞。

本研究存在兩點缺陷：首先，APE發生后肺組織中CD147發揮的作用可能比本研究中描述的要復雜的多。盡管我們的實驗結果提示中性粒細胞是CD147作用的主要靶細胞，但不能排除CD147還作用于其他通路或其他細胞，比如血小板。有研究證實CD147還能通過磷酸肌醇-3-激酶/Akt-信號通路激活血小板，促進血小板的聚集和血栓的形成[24]。這一途徑很有可能也存在于APE發生后的病理生理變化中。此外，我們并沒有進一步探討CD147表達升高后引起炎性細胞聚集的具體機制。未來需要進一步研究CD147對APE后肺血管中循環血小板的影響以及CD147表達促進肺組織中炎性反應的具體機制。

總之，本實驗通過介入技術制作了一種簡單、可重復性高的大鼠APE模型，并用該模型初步證實CD147通過促進炎癥反應參與了APE后肺動脈壓力的升高，提示CD147可能是治療APE患者的一個新的靶點。