加減益經湯對卵巢功能減退大鼠轉化生長因子β超家族相關成員的影響

李麗美， 夏建紅， 黃雪萍， 陳婷婷， 和秀魁

（1.廣東省婦幼保健院婦保科，廣東廣州 510095；2.廣東省婦幼保健院保健部，廣東廣州 510095；3.廣東省婦幼保健院婦科，廣東廣州 510095）

加減益經湯是廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科張玉珍、陶莉莉教授的臨床經驗方，用于治療卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）引起的月經不調、不孕、性激素不足等疾病，療效顯著。前期臨床研究發現，加減益經湯可明顯改善腎虛肝郁證卵巢功能減退患者的臨床癥狀、性激素水平及妊娠率[1-3]，可恢復環磷酰胺導致的卵巢功能減退大鼠的動情周期，改善性激素水平[1]，但其機制尚不明確。轉化生長因子β（TGF-β）超家族相關成員對卵泡的生長、發育、成熟、閉鎖，甾體激素的產生起著重要的調控作用[4]。另外，前期實驗研究證實，采用單次腹腔注射75 mg/kg環磷酰胺法可成功構建卵巢功能減退大鼠模型[1，5]，因此，本研究同法復制卵巢功能減退大鼠模型，以補佳樂為陽性對照藥，觀察加減益經湯對TGF-β超家族中相關成員的影響，以期明確其抗卵巢功能減退的作用機制。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級12周齡健康成年雌性SD大鼠60只，體質量（230±10）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0002。經陰道脫落細胞涂片篩查，動情周期均正常。室溫20～25℃，光照14 h，相對濕度45%～55%。

1.2 藥物、試劑與儀器加減益經湯組成包括熟地黃20 g，黨參20 g，菟絲子20 g，當歸10 g，丹參15 g，白芍10 g，柴胡6 g等9味中藥[1，6-7]。將上述中藥材水煎并濃縮為每毫升含生藥2.358、1.179、0.589 5 g的藥液，裝瓶冷藏備用（由廣東省中醫研究所制備），應用時以蒸餾水調配。戊酸雌二醇（補佳樂），為法國DELPHARMLille S.A.S公司產品，批號：251A2。環磷酰胺，山西普德藥業有限公司產品，批號：04130301；抗苗勒氏管激素（AMH）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、抑制素B（INHB）ELISA試劑盒，均為上海西唐生物科技有限公司產品；AMH抗體與TGF-β1抗體為美國Santa Cruz生物技術公司產品；骨形態發生蛋白15（BMP-15）與轉化生長因子-β1受體（TGF-β1R）為武漢博士德生物科技有限公司產品。Bio-Rad 680酶標儀，美國伯樂公司產品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統，日本奧林巴斯公司產品。

1.3 動物模型的制備、分組與給藥將60只大鼠按隨機數字表分出10只作為空白組，給予1 mL生理鹽水腹腔注射；其余50只大鼠給予環磷酰胺75 mg/kg（加生理鹽水配制成1 mL藥液）單次腹腔注射構建卵巢功能減退模型[1，5，8]。環磷酰胺造模后，大鼠出現精神差、蜷臥少動、脫毛、易激惹等表現，提示造模成功。將造模成功的大鼠采用完全隨機分組法分為加減益經湯高、中、低劑量組，補佳樂組，模型組，每組10只。加減益經湯高、中、低劑量組參考《中藥藥理研究方法學》分別給予加減益經湯23.58、11.79、5.895 g·kg-1·d-1（生藥劑量）灌胃；補佳樂組參考《中藥藥理研究方法學》給予補佳樂（與生理鹽水配成混懸液）0.09 mg·kg-1·d-1灌胃；模型組與空白組灌胃10 mL·kg-1蒸餾水。造模后2 h開始灌胃給藥，1次/日，連續4周。

1.4 觀察指標與方法模型組在造模后2周，其余組在結束給藥后，篩查出處于動情間期的大鼠，斷頸處死。腹主動脈采血，室溫靜置30 min后離心分離血清置于-80℃保存待測。以雙抗體夾心ELISA法測定血清AMH、INHB水平。卵巢組織切片后，采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法按試劑盒說明書分別測定AMH、TGF-β1、TGF-β1R、BMP-15蛋白表達。采集免疫組織化學圖像，用Image-Pro Plus分析軟件進行圖像分析，每張切片于400倍鏡下隨機選取5個視野，進行積分光密度（IOD）測定。IOD代表目的蛋白表達強度。

1.5 統計方法采用SPSS 21.0 For Windows統計分析軟件進行數據處理。所有計量資料均以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較表1結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清AMH、INHB水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組血清AMH水平明顯升高（P＜0.01），加減益經湯高、中劑量組血清INHB水平明顯升高（P＜0.01），且各治療組之間AMH、INHB比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of AMH and INHB in various groups （±s，pg·mL-1）

表1 各組大鼠血清AMH、INHB水平的比較Table 1 Comparison of the serum levels of AMH and INHB in various groups （±s，pg·mL-1）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補佳樂組加減益經湯高劑量組加減益經湯中劑量組加減益經湯低劑量組INHB 150.54±19.05 87.89±17.97①111.25±13.84 120.14±22.96②124.11±19.96②111.14±20.81鼠數（只）10 10 10 10 10 10 AMH 17.32±1.96 9.87±1.72①15.97±1.87②14.75±2.06②14.66±2.33②14.10±1.76②

2.2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達水平的比較表2，圖1~2結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R IOD值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1RIOD值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且各治療組之間TGF-β1、TGF-β1R比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達水平的比較Table 2 Comparison of the expression levels of TGF-β1 and TGF-β1R in rat ovarian tissue of various groups （±s）

表2 各組大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達水平的比較Table 2 Comparison of the expression levels of TGF-β1 and TGF-β1R in rat ovarian tissue of various groups （±s）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補佳樂組加減益經湯高劑量組加減益經湯中劑量組加減益經湯低劑量組TGF-β1RIOD值10 930.35±1 089.87 6 086.16±1 366.70①8 327.58±500.56③8 663.30±585.01③8 352.32±665.88③8 055.16±640.42②鼠數（只）10 10 10 10 10 10 TGF-β1 IOD值39 520.25±3 034.53 20 976.87±3 385.54①27 811.26±1 889.68②29 793.98±3 566.76③28 565.70±3 198.38③27 342.17±1 991.62②

圖1 各組大鼠卵巢TGF-β1陽性表達分布的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 1 Comparison of the distribution of positive expression of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖2 各組大鼠卵巢TGF-β1R陽性表達分布的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 2 Comparison of the distribution of positive expression of TGF-β1 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

2.3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達水平的比較表3，圖3~4結果顯示：與空白組比較，模型組AMH、BMP-15的IOD值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組AMH、BMP-15 IOD值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且各治療組之間AMH、BMP-15 IOD值比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達水平的比較Table 3 Comparison of the expression levels of AMH and BMP-15 in ovarian tissue of various groups （±s）

表3 各組大鼠卵巢AMH、BMP-15表達水平的比較Table 3 Comparison of the expression levels of AMH and BMP-15 in ovarian tissue of various groups （±s）

①P<0.01，與空白組比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組比較

組別空白組模型組補佳樂組加減益經湯高劑量組加減益經湯中劑量組加減益經湯低劑量組BMP-15 IOD值340 535.46±27 495.48 222 745.08±20 023.42①278 137.75±34 202.27②294 423.19±22 992.96③290 052.26±20 929.47③282 033.55±25 234.15②鼠數（只）10 10 10 10 10 10 AMH IOD值24 276.68±3 122.93 12 083.57±1 396.84①20 237.66±1 276.56③21 201.72±1 544.98③21 208.65±2 483.95③19 479.61±2 019.62③

圖3 各組大鼠卵巢AMH陽性表達分布的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 3 Comparison of the distribution of positive expression of AMH in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

圖4 各組大鼠卵巢BMP-15陽性表達分布的比較（免疫組織化學法，×400）Figure 4 Comparison of the distribution of positive expression of BMP-15 in rat ovarian tissue of various groups（by immunohistochemistry，×400）

3 討論

中醫學將卵巢功能減退歸屬于“經水早斷”“血枯”“不孕”等病證范疇。《傅青主女科》將其描述為“年未老而經水斷”，采用益經湯治療。張玉珍教授[9]認為本病病機為脾腎虧虛，肝郁血瘀，治法為補腎健脾、疏肝活血，采用加減歸腎丸治療。陶莉莉教授認為此病腎虛乃是根本，情志因素是誘發卵巢功能減退的重要病因，采用加減益經湯治療[1-3]。加減益經湯是在益經湯的基礎上加減化裁而來，方中：以熟地黃、菟絲子、黨參為君，補腎健脾；以杜仲、丹參、北沙參為臣，補腎活血，補而不燥；當歸、白芍為佐，補血柔肝；柴胡為使，疏肝氣。全方配伍合理、簡潔，腎、脾、肝、心、肺五臟同調，共奏補腎健脾，疏肝活血之功。前期臨床研究發現，加減益經湯可改善腎虛肝郁證卵巢功能減退患者的臨床癥狀，提高妊娠率，降低卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）水平，升高雌二醇（E2）含量[1-3]；動物實驗證實，加減益經湯可恢復環磷酰胺導致的卵巢功能減退大鼠的動情周期，改善各級卵泡數目，降低FSH、LH水平，升高E2含量，但機制尚不明確[1]。

卵巢衰老的機制是由多種生理及外界因素相互作用和逐漸積累的生物學現象，卵泡數目減少、卵泡質量降低是導致卵巢衰老從而引起生育問題以及絕經的關鍵原因。卵泡啟動、生長發育、退化及甾體激素合成除受下丘腦-垂體-卵巢軸（HPOA）調節外，還受多種卵巢局部分泌的生長因子、細胞因子和激素等所構成的復雜調控網絡調節[10]。近年來，許多研究表明，TGF-β超家族中的AMH、INHB、TGF-β1、BMP-15參與了卵巢生理和病理過程的調控，對卵泡的發育起著重要的調控作用[11]。因此，本研究從TGF-β超家族中對卵巢發育起重要作用的細胞因子與受體入手，以環磷酰胺誘導的卵巢功能減退模型大鼠為研究對象，觀察卵巢功能減退大鼠TGF-β超家族中AMH、INHB、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的變化以及高、中、低劑量加減益經湯干預的作用機制。

AMH主要由卵巢竇前卵泡及小的竇狀卵泡的顆粒細胞分泌，它可以相對真實地反映原始卵泡庫存量[1，12]。它的作用是維持原始卵泡持續處于靜止狀態，抑制其向初級卵泡的轉化，可作為預測卵巢儲備功能及促排卵過程中卵巢反應性的血清學標記物[13]。AMH作為評估卵巢儲備功能的指標，對卵巢損傷的評估具有意義[14-15]。本研究結果顯示，卵巢功能減退模型大鼠血清AMH與卵巢AMH的表達降低，經加減益經湯治療后，卵巢功能減退大鼠血清與卵巢AMH的表達升高。表明加減益經湯可通過上調AMH的表達而促進卵泡發育，抑制卵泡過度閉鎖，提高卵巢儲備力。

INHB作為早期預測卵巢儲備功能下降的指標，是診斷卵巢功能減退的敏感指標之一[16]。Yong等[17]發現，INHB的上升與卵巢顆粒細胞功能的恢復呈正相關，推測INHB可作為評估卵泡發育或預測卵母細胞恢復的標志物。研究發現，補腎中藥可增加血清INHB水平，改善卵巢儲備功能，抑制卵泡過度閉鎖[18]。本研究結果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢INHB分泌減少，經加減益經湯干預后，血清INHB分泌增加，且呈現出劑量依賴性，高、中劑量組明顯，而補佳樂作用不大。表明加減益經湯可通過上調INHB的分泌而提高卵巢儲備功能。

TGF-β1在原始卵泡的募集及原始卵泡池的維持方面起重要調控作用[19]。TGF-β1R是TGF-β1發揮作用的重要組成部分。有研究發現，卵巢功能減退和POF患者血清中TGF-β1的水平較正常人明顯降低[20]。本研究結果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢TGF-β1、TGF-β1R表達水平降低，經加減益經湯干預后，卵巢TGF-β1與TGF-β1R的表達水平升高。表明加減益經湯可通過上調卵巢TGF-β1、TGF-β1R的表達，促進卵泡的生長、發育。

BMP-15是X染色體上首個被證實的對維持卵巢儲備及決定絕經年齡有著關鍵作用的劑量效應基因[21]。BMP-15對卵泡的早期發育極其重要，其基因突變可能是卵巢功能減退或POF發生、發展的機制之一[22]。本研究結果顯示，卵巢功能減退模型大鼠卵巢BMP-15表達降低，經加減益經湯干預后，卵巢BMP-15的表達升高。表明加減益經湯可通過上調卵巢BMP-15的表達促進卵泡早期發育，從而提高卵巢儲備功能。

綜上所述，加減益經湯改善卵巢儲備功能可能與調節卵巢TGF-β超家族成員AMH、INHB、BMP-15、TGF-β1、TGF-β1R的表達有關。