Illumina Miseq高通量測序方法對袋裝番茄醬微生物多樣性分析

張雙虹，劉孟濤，陸婉瑤，趙抒娜,, ，王 婧，閆金萍

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；2.中糧糖業(yè)控股股份有限公司，農(nóng)業(yè)部糖料與番茄質(zhì)量安全控制重點實驗室，新疆昌吉 831100）

番茄是一年生茄科草本植物[1]，酸甜可口，含有可溶性糖[2]、有機酸、維生素[3?4]、蛋白質(zhì)、番茄紅素[5?6]、多酚類物質(zhì)[7]、黃酮類[8?9]和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)和功能活性成分[10?11]，具有控制高血壓、抗癌治癌、降低動脈硬化、抗衰老等功能[12]，食用番茄及其制品能有效降低乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病、肥胖等慢性疾病的發(fā)病風險[13]。全球的加工番茄種植地區(qū)集中在美國的加州河谷、地中海沿岸和中國的新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地[14?15]。新疆地區(qū)氣候干燥、晝夜溫差大，這一獨特的地理環(huán)境造就了優(yōu)質(zhì)的原料，其生產(chǎn)的番茄番茄色素和干物質(zhì)含量更高[16]，生產(chǎn)的番茄醬以大包裝為主[17]，主要出口日本、俄羅斯、歐盟等國家和地區(qū)[18]。與新鮮番茄相比，番茄醬的營養(yǎng)成分更易被人體吸收[19]。

番茄醬是成熟番茄經(jīng)一系列加工工藝制成[20]，番茄醬的生產(chǎn)包括原料流送、提升、破碎、預熱、打漿精制、過濾、蒸發(fā)、殺菌、無菌灌裝等多個過程[21?22]。番茄醬的生產(chǎn)過程經(jīng)過嚴格的原料篩選和加工過程控制，最終得到的成品以鋼桶、木桶、袋裝等多種形式進行包裝，成品的番茄醬一般在保質(zhì)期內(nèi)符合商業(yè)無菌的要求[23?24]。事實上，殺菌不徹底、灌裝后二次污染等容易導致番茄醬成品感染腐敗微生物，出現(xiàn)變酸、醬體形態(tài)改變、產(chǎn)氣脹袋等現(xiàn)象，因此研究番茄醬成品中的微生物的種類和數(shù)量非常重要。針對這類變質(zhì)問題，眾多學者一直開展相關(guān)研究，提供適宜的解決方案。目前鑒定出的引起番茄醬產(chǎn)氣變質(zhì)的微生物主要有細菌、酵母菌和霉菌。如黃玲等[25]從脹袋番茄醬中分離出季也蒙假絲酵母和叢生胞絲酵母；黃忠梅等[26]利用全自動微生物生化分析儀鑒定從番茄醬中分離得到的微生物，包括埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬等；曾獻春等分離得到了枯草芽孢桿菌和棲稻黃色單胞菌[27]；吳彩蘭研究表明，在新疆番茄中分離得到的內(nèi)生細菌中芽孢灰棗桿菌分離頻率最高、數(shù)目最多，是加工番茄內(nèi)生細菌的主要優(yōu)勢種群[28]；李慧等對脹桶番茄醬中的腐敗微生物進行分離鑒定，利用形態(tài)特征觀察、序列分析和生理生化性質(zhì)鑒定的方法，表明主要腐敗微生物為厚壁類芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌和奧默畢氏酵母[29]。巴哈提古麗等對感官異常番茄醬分離的菌株進行鑒定，得到分離的9株細菌分別為芽孢灰棗桿菌類和腸球菌類[30]。對于脹氣番茄醬的研究，學者們大多通過選擇性培養(yǎng)基對微生物進行培養(yǎng)和分離，進一步對菌株進行鑒定，但由于微生物的可培養(yǎng)性和培養(yǎng)條件的不同，在微生物的數(shù)量及種類上可能產(chǎn)生不同的結(jié)論，無法全面反映菌群的結(jié)構(gòu)組成。

高通量測序技術(shù)的發(fā)展為全面反映不同樣品中的微生物群落的組成提供了可行的技術(shù)手段[31]，可以鑒定一些不易培養(yǎng)的微生物，通過微生物的多樣性和相對豐度實現(xiàn)準確定性和定量分析[32?33]。本研究針對番茄醬產(chǎn)品的產(chǎn)氣脹袋問題，通過高通量測序技術(shù)對不同番茄醬產(chǎn)品中的微生物多樣性進行分析，深入了解番茄醬產(chǎn)品中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其差異，從微生物分類學方向確認引起番茄醬脹氣的微生物類型，以期為生產(chǎn)企業(yè)控制微生物污染風險、降低經(jīng)濟損失、保證食品質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

袋裝番茄醬樣品 新疆地區(qū)市場采購及工廠內(nèi)控產(chǎn)品收集，包括正常的袋裝番茄醬A1、A2和已脹袋番茄醬A3、A4；MRS培養(yǎng)基、瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒 OMEGA公司。

恒溫培養(yǎng)箱 上海精密科學儀器有限公司；超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 日本YAMATO公司；電泳槽 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 上海復日科技有限公司；PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理及總DNA的提取 取適量番茄醬樣品放入2 mL樣品管，在組織破碎儀中進行破碎后提取。按照OMEGA公司細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取基因組DNA，用Qubit3.0DNA檢測試劑盒檢測基因組DNA的濃度。

1.2.2 PCR擴增及其測序 以獲得的基因組DNA為模板對細菌16S rDNA進行PCR擴增。16S rDNA序列擴增所用引物擴增16S rDNA的V3-V4區(qū)域：上游引物341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3',下游引物805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAAT CC-3'。

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，進入循環(huán)程序，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，循環(huán)5個循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)20個循環(huán)，再72 ℃終延伸5 min。第二輪PCR擴增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，95 ℃預變性3 min，進入循環(huán)程序，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)5個循環(huán)，再72 ℃終延伸5 min。PCR反應完成后將PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，使用Illumina Miseq測序平臺進行測序。

1.2.3 番茄醬指標的測定 乳酸菌計數(shù)按照食品安全國家標準GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行檢測[34]。以無菌操作稱取25 g番茄醬樣品，置于裝有225 mL生理鹽水的均質(zhì)袋內(nèi)，混勻制成1:10樣品勻液，并依次制備10倍梯度樣品勻液稀釋備用。取各梯度稀釋樣品勻液1 mL于無菌平皿中，每個稀釋度2個平皿。將15~20 mL冷卻至48 ℃的MRS培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。冷卻后翻轉(zhuǎn)平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧條件下培養(yǎng)。72 h后計數(shù)乳桿菌屬細菌數(shù)目。pH的測定：取適量番茄醬樣品，用pH計進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于Illumina Miseq平臺測序得到的樣品文庫，根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)，對樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。使用Usearch軟件按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類分析，篩選出代表序列。利用RDP 16S數(shù)據(jù)庫和NCBI 16S數(shù)據(jù)庫進行分類學研究，統(tǒng)計每個樣品在門、屬分類水平上的序列數(shù)目。利用Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)等方法完成多樣性指數(shù)分析，使用R軟件繪制稀釋性曲線、Rank abundance曲線、樣本相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與質(zhì)量分析

4份樣品共產(chǎn)生350344條有效序列，平均長度約為421bp，由稀釋性曲線（圖1）可見，測序序列數(shù)大于25000時，曲線上升緩慢，表明測序數(shù)據(jù)量繼續(xù)增加，新增OTU數(shù)有限，本次測序的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種，數(shù)據(jù)量足夠。Rank abundance曲線表明（圖2），樣品微生物的豐富程度和均勻程度存在差異，其中番茄醬樣品A1、A2曲線較平緩，水平跨度大，物種的組成豐富，均勻程度高；番茄醬異常樣品A3、A4曲線較陡峭，水平跨度小，微生物豐度較低，某一類或幾類微生物占了大部分比例，具有數(shù)量優(yōu)勢。

圖 1 高通量測序樣本的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of the tested samples based on high-throughput sequencing

圖 2 高通量測序樣本的Rank-abundance曲線Fig.2 Rank abundance curves of the tested samples based on high-throughput sequencing

2.2 番茄醬樣品的Alpha多樣性指數(shù)分析

由表1可知，四個樣品來看，四個樣品的Coverage指數(shù)相同，均為1.00，表明測序能反映樣品的真實情況。番茄醬正常樣品A1、A2的OTUs、Shannon、

表 1 番茄醬樣品中細菌Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity indexes of bacterial communities in tomato sauce samples

Chao、Ace、Shannoneven指數(shù)都高于脹袋樣品A3、A4，說明樣品A1、A2的Alpha多樣性高，樣品中的微生物豐富度和均勻度比較高。樣品A1和A2的Shannoneven指數(shù)相近，樣品A3和A4的Shannoneven指數(shù)相近，說明兩兩之間的微生物群落多樣性和分配均勻程度相似，而A1、A2和A3、A4之間存在差異性；同時說明兩個番茄醬脹袋樣品之間的微生物多樣性相似。樣本相關(guān)性熱圖（圖3），樣品A1和A2的樣本相似性較高，樣品A3和A4的樣本相似性較高，而正常樣品與異常樣品之間微生物群落差異較大。

圖 3 不同番茄醬樣本相關(guān)性熱圖Fig.3 Heatmaps of corrlation between tomato sauce samples

2.3 門水平菌群結(jié)構(gòu)

圖4 為各樣品門水平豐度分布的柱形圖。番茄醬正常樣品A1中，優(yōu)勢物種為變形菌門（Proteobacteria），平均占比為83.2%，其余包括厚壁菌門（Firmicutes）平均占比7.32%、擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占比3.3%、放線菌門（Actinobacteria）平均占比2.58%以及其他分類。番茄醬正常樣品A2中，優(yōu)勢物種為變形菌門（Proteobacteria）平均占比87.4%，其余包括厚壁菌門（Firmicutes）平均占比4.86%、擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占比4.8%、放線菌門（Actinobacteria）平均占比0.86%以及其他分類。番茄醬異常樣品A3中，優(yōu)勢物種為厚壁菌門（Firmicutes）平均占比96.96%，其余包括變形菌門（Proteobacteria）平均占比2.93%，擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占比0.07%、放線菌門（Actinobacteria）平均占比0.01%以及其他分類。番茄醬異常樣品A4中，優(yōu)勢物種為厚壁菌門（Firmicutes）平均占比97.45%，其余包括變形菌門（Proteobacteria）平均占比2.46%，擬桿菌門（Bacteroidetes）平均占比0.04%、放線菌門（Actinobacteria）平均占比0.01%以及其他分類。樣品A1和A2之間主要優(yōu)勢菌門相同，相對豐度差異不大。樣品A3和A4之間情況相同。各樣本門水平分布情況表明，番茄醬正常樣品與異常樣品之間微生物組成存在明顯差異。

表 2 番茄醬樣品中菌屬相對豐度表Table 2 Relative abundance of bacteria genera in the tomato sauce samples

圖 4 門水平不同番茄醬樣品物種分布相對豐度Fig.4 Distribution of microbial communities in different tomato sauce samples at the phylum level

圖 5 屬水平不同番茄醬樣品物種分布相對豐度Fig.5 Disttibution of microbial communities in tomato sauce samples at the genus level

2.4 屬水平菌群結(jié)構(gòu)

在屬的水平上統(tǒng)計顯示（圖5），不同番茄醬樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和相對豐度不同。番茄醬異常樣品菌相較為單一，乳桿菌屬比例在樣品A3和A4中分別達到96.89%和97.38%（表2），表明乳桿菌屬是主要的污染微生物。而番茄醬正常樣品的菌落組成較為豐富，但與異常樣品相比微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，主要為植物和土壤中的一些微生物類別，包括存在于土壤中的伯克氏菌屬（Burkholderiaspp.）、存在于土壤和水中的柄桿菌科某屬PMMR1spp.、存在于植物中的勞爾氏菌屬（Ralstoniaspp.）、存在于植物內(nèi)的固氮菌草螺菌屬（Herbaspirillumspp.）、存在于土壤和環(huán)境中的鞘氨醇桿菌科某屬Chitinophagaspp.以及存在于植物中的慢生根瘤菌（Bradyrhizobiumspp.）等。番茄醬樣品中的微生物種類可能受原料、生產(chǎn)地點、生產(chǎn)工藝等多種因素的影響。在以往番茄醬脹罐樣品的相關(guān)報道中，發(fā)現(xiàn)的微生物包括芽胞桿菌、酵母菌、埃希氏菌屬等。如楊紅紅等[35]對新疆胡陽河番茄制品有限公司提供的脹罐番茄醬中微生物進行分離研究，發(fā)現(xiàn)導致番茄醬脹袋的主要微生物是芽孢桿菌、酵母菌和霉菌；丁生林等[36]報道了中糧屯河食品分析檢測研究中心從番茄醬中分離出乳球菌和芽孢桿菌；黃忠梅等[26]對脹袋及正常罐裝的番茄醬進行培養(yǎng)得到的20株菌株進行鑒定，結(jié)果表明所檢出的20株菌株分別為埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬等。而本研究通過客觀測序結(jié)果提出了不同的觀點，在本研究所篩查的樣品中多見于報道的酵母菌和芽胞桿菌并不是主要優(yōu)勢菌種，反而是耐熱能力較差的乳酸菌是主要菌種，與以往人們認為殺菌溫度偏低導致某些耐熱菌種不能被徹底殺滅的印象并不吻合。

番茄醬是酸性罐裝食品，其生產(chǎn)過程中的殺菌和無菌過濾能夠徹底殺菌。但是如果在加工過程中殺菌不徹底，容易因微生物的殘留而引起腐敗[37]。產(chǎn)芽胞細菌的耐熱性和魯棒性較好，芽胞桿菌引起的腐敗可能由于密封不良、殺菌溫度不足，容易導致兼性厭氧菌的持續(xù)存活而引起腐敗。本研究發(fā)現(xiàn)番茄醬異常樣品中乳桿菌屬大量存在，可能是由于運行過程中物料控制存在波動，造成局部殺菌不徹底或殺菌后在過濾工段及密封環(huán)境存在的二次污染，造成乳桿菌的大量繁殖，乳酸菌能夠耐受酸度較低的條件，乳酸菌將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸，降低番茄醬產(chǎn)品的pH，產(chǎn)氣使樣品出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象，造成番茄醬腐敗變質(zhì)。以往通過后期培養(yǎng)得到芽孢桿菌等耐熱性好的菌種為主要優(yōu)勢菌種，從治理的角度上去考慮，可能需要在生產(chǎn)環(huán)節(jié)提高殺菌溫度以保證耐熱菌種被殺滅，由此造成局部過熱，反而產(chǎn)生一些焦糊的不良風味，番茄醬的顏色也會加深，影響番茄醬的整體品質(zhì)。

而通過本研究發(fā)現(xiàn)，并不耐熱的乳桿菌也有可能是造成品質(zhì)劣變的主要原因，因此在加工環(huán)節(jié)需要側(cè)重的重點可能并不是全程過度提升加熱溫度，而是在加工環(huán)節(jié)維持比較穩(wěn)定的物料生產(chǎn)，并且規(guī)范管理好生產(chǎn)環(huán)境，也可以滿足實際生產(chǎn)的滅菌需求，并且還不會因過熱造成不良風味和色值加深等影響番茄醬感官品質(zhì)的問題。

2.5 乳桿菌屬計數(shù)及理化指標測定

對番茄醬樣品依據(jù)GB 4789.35-2016乳桿菌屬測定方法進行檢測，并觀察番茄醬醬體形態(tài)，結(jié)果如表3所示。與正常樣品相比較，番茄醬脹袋樣品中乳桿菌屬微生物大量繁殖，這與高通量測序的結(jié)果相一致。番茄醬脹袋樣品的醬體pH降低，帶來醬體酸度的改變，呈現(xiàn)酸腐氣味。這說明乳桿菌屬微生物是造成番茄醬產(chǎn)氣脹袋的原因，在生產(chǎn)過程中應注意預防和控制，消除產(chǎn)品潛在的安全隱患。

表 3 不同番茄醬樣品的理化指標Table 3 Physicochemical properties of different tomato sauce

3 討論與結(jié)論

研究采用高通量測序技術(shù)，獲得了350344條有效序列數(shù)，更好地揭示了番茄醬制品微生物群落的多樣性。以往研究以微生物培養(yǎng)和分離為主，鑒定出的微生物主要包括酵母菌、霉菌、埃希氏菌屬以及芽孢桿菌。本實驗首次從整體水平上詳述了番茄醬制品中屬分類水平的細菌微生物群落結(jié)構(gòu)，異常樣品中鑒定出的主要為乳桿菌屬，正常樣品中鑒定出的細菌包括乳桿菌屬、伯克氏菌屬、勞爾氏菌屬、草螺菌屬、慢生根瘤菌等，在以往研究中未見報道，為可能造成番茄醬脹袋的原因提供了新的視角。

高通量測序可以快速準確全面地反映檢測樣品中微生物的群落組成，對于低豐度、難以培養(yǎng)甚至不可培養(yǎng)的微生物也能很好的鑒別。但是高通量測序的方法基于基因組的抽提和擴增測序，無法對樣品中的存活微生物的情況作出判斷。本實驗采用測序方法結(jié)合計數(shù)方法來研究引起番茄醬脹袋的主要微生物，通過實驗可以得出，番茄醬正常樣品與脹袋樣品之間菌群結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，脹袋番茄醬樣品中的主要微生物是乳桿菌屬，說明乳桿菌屬是引起番茄醬腐敗的主要微生物，在生產(chǎn)中應引起重視。實驗結(jié)果對番茄醬生產(chǎn)工藝優(yōu)化與控制起到一定的指導作用，對推進解決番茄醬變質(zhì)腐敗這一行業(yè)問題具有重要的意義。

此外，本實驗首次通過測定16S V3~V4可變區(qū)域來研究番茄醬制品中的細菌微生物，通過高通量測序技術(shù)來研究番茄醬制品的微生物群落組成和豐度結(jié)構(gòu)，并且對快速診斷生產(chǎn)中可能存在的問題提供依據(jù)，做到有的放矢地解決產(chǎn)業(yè)運行過程中的實際問題。通過對某一生產(chǎn)廠家或某段生產(chǎn)時期的數(shù)據(jù)采集，可以有針對性地為番茄醬脹袋問題進行數(shù)據(jù)收集及分析，為控制產(chǎn)品生產(chǎn)風險、保證產(chǎn)品質(zhì)量安全提供良好的技術(shù)支持和精準的解決方案。