不同冰凍條件對肌性組織標本凍存效果的影響

孫紅星，竇永青，韓 梅*

(1.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學生物化學與分子生物學教研室，河北 石家莊 050017)

組織切片作為醫學研究中最常用的實驗方法，保存良好的組織形態是后續實驗重要的前提，最常見的是石蠟切片和冰凍切片兩種類型。石蠟切片雖然可以使組織表現出良好形態[1]，但脫水、透明等中間環節中的有機試劑會使組織樣品中的蛋白質發生不同程度的變性，而冰凍切片可以更好的保持組織細胞抗原的活性而被廣泛應用[2]。冰凍切片主要應用于一些組織化學方法和免疫組織化學方法、臨床手術的快速病理診斷等。冰凍切片的質量受多種因素的影響，如取材手法、冰凍方法、切片方法等，其中凍存方法[3]或冰凍速度[4]對組織有明顯的影響。然而，對于不同肌性組織(如骨骼肌、心肌和平滑肌)標本最適宜的冰凍條件尚無比較性研究證據。常用的組織標本冰凍有三種方式：①將組織直接投放到液氮中(簡稱液氮浸入法)，使其快速冷凍；②將組織放入錫紙托中，漂浮于液氮上(簡稱液氮漂浮法)，使其以慢于液氮浸入法的速度冷凍；③將組織直接置于-80 ℃冰箱(簡稱直接-80 ℃法)，使其以更慢的速度冷凍。本研究通過切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色對比這三種方法處理的骨骼肌、平滑肌和心肌組織形態差異，以期能夠得出不同肌性組織冰凍方法的最優條件。

1 材料與方法

1.1實驗動物 本實驗所用動物為鼠齡8～12周的C57BL/6野生小鼠。飼養于溫度濕度恒定的獨立通氣籠盒系統中，標準鼠糧飼養，飲水為純凈水，自由進食水。環境采用12 h明暗循環，7:00～19:00照明，19:00～次日7:00無照明。

本研究所涉及動物實驗已經河北醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2試劑和儀器 手術器械(剪刀，鑷子，止血鉗，紗布)均經121 ℃，高壓滅菌30 min，冰凍切片OCT包埋劑 (Leica)，冰凍切片機(LEICA CM 1950)，刀片(LEICA 819)，載玻片，蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)，中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)，無水乙醇，二甲苯，HE染液，正置顯微鏡(LEICA DM 2000 LED)。

錫紙托的制作：用適量錫紙(深圳市都利實業有限公司)做成一定厚度的近似桶狀的托，透明膠帶粘牢且保證無漏洞，用金屬絲穿過錫紙托上方打好的等距三個孔起到平衡和固定作用。

1.3組織取材

1.3.1腓腸肌取材 用4%水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠置于解剖板上，四肢固定。鈍性分離后取下完整腓腸肌放到OCT包埋劑中，保持位置豎直使切片時可以得到其橫截面。

1.3.2心臟取材 剪開胸腔，暴露心臟，將右心房剪破，用掛在2 m高處與輸液瓶相連的輸液針頭刺入左心室，灌入約50 mL于4 ℃預冷的生理鹽水，以沖洗血液。灌流后取下完整心臟放到OCT包埋劑中，切片時從心尖切起，待有明顯心腔的位置留下切片。

1.3.3胸主動脈取材 灌流后剪下相應位置血管，為避免人為用力撕扯血管改變結構，未剝離周圍組織，將其放到OCT包埋劑中，切片時留取血管的橫截面，即完整的環形結構。

1.4條件處理

1.4.1液氮浸入法 將5塊組織包埋好后鑷子夾住，直接接觸液氮并緩慢投入液氮中，包埋劑10～20 s后凝固變白即為凍實。隨后放入-80 ℃冰箱。

1.4.2液氮漂浮法 將5塊包埋好的組織放入錫紙托，提起金屬絲放入液氮，錫紙托直接接觸液氮，組織非直接接觸。包埋劑凍實比液氮浸入法緩慢，待完全凝固變白即為凍實，隨后投入液氮中暫存再放入-80 ℃冰箱。

1.4.3直接-80 ℃法 將5塊包埋好的組織直立放在-80 ℃冰箱里，凍存過夜。

1.5切片方法 所用儀器為Leica冰凍切片機。將冰凍切片機待機狀態調整為工作狀態，箱體溫度，刀頭溫度設定為-20 ℃，同時將鑷子、刀片、毛筆等放入箱體內預冷。待達到指定溫度后，將組織塊安裝到組織夾持器上，調整好刀片與組織塊的距離和角度。先用舊刀片進行組織粗修，厚度為40 μm，看到明顯的組織暴露后，換用鋒利的新刀片進行切片，切20片，切下的完整無褶皺的組織薄片迅速的貼附在干凈載玻片上，并做好標記。

1.6HE染色 將切片復水后置于蘇木素染液2 min，水洗2 min，用1%鹽酸乙醇分化15 s，水洗2 min，伊紅染液3 s，水洗1 min，70%乙醇2～3 s，80%乙醇2～3 s，90%乙醇2～3 s，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯透明后中性樹膠封片。

1.7圖像采集及研究指標 用正置光學顯微鏡在10倍和40倍鏡下觀察，每張切片選取5個同等位置的視野并采集圖像；以切片組織完整性良好，無空泡和撕裂縫隙作為質量滿意標準，進行對比和分析。比較同一種組織標本經三種不同凍存方法處理后，計算符合滿意條件的切片數量占總切片數量的百分率。

1.8統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗。P<0.05為差異統計學意義。

2 結 果

2.1骨骼肌(腓腸肌)冰凍條件優化 液氮浸入法處理的腓腸肌結構較為完整，肌束緊密、規則，筋膜清晰、完整，液氮漂浮法處理的切片肌束出現密集、不規則空泡，筋膜邊界模糊，直接-80 ℃法處理的骨骼肌切片形態結構發生了極其明顯的變化，正常的肌束形態完全喪失，出現大量的冰晶空泡，效果最差，見圖1。液氮浸入法的切片滿意度高于液氮漂浮法和直接-80 ℃法，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 三種冰凍條件下腓腸肌結構改變的比較A.液氮浸入法的腓腸肌形態結構( ×10)；B.液氮漂浮法的腓腸肌形態結構( ×10)；C.直接-80 ℃法的腓腸肌形態結構( ×10)；D.液氮浸入法的腓腸肌形態結構( ×40)；E.液氮漂浮法的腓腸肌形態結構( ×40)；F.直接-80 ℃法的腓腸肌形態結構( ×40)Figure 1 Comparison of the structural changes of gastrocnemius under three freezing conditions

表1 小鼠腓腸肌不同冰凍條件下切片滿意率Table 1 The satisfaction of mouse gastrocnemius sections under different freezing conditions

2.2心肌冰凍條件優化 用液氮浸入法和液氮漂浮法處理的心肌組織標本，大體結構都比較完整，液氮浸入法的組織切片可見到明顯的組織裂隙且數量較多，液氮漂浮法處理的標本，結構更為致密，直接-80 ℃法可完全破壞心肌組織的形態，見圖2。液氮漂浮法切片滿意度高于液氮浸入法和直接-80 ℃法，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠心肌不同冰凍條件下切片滿意率Table 2 The satisfaction of mouse myocardium sections under different freezing conditions

2.3血管(動脈)冰凍條件優化 液氮浸入法和液氮漂浮法保存的血管壁形態均保持完整，內膜和中膜結構清晰，而直接-80 ℃法出現較多冰晶縫隙，管壁各層紊亂，見圖3。液氮浸入法和液氮漂浮法比較差異無統計學意義(P>0.05)，三種方法比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 小鼠動脈不同冰凍條件下切片滿意率Table 3 The satisfaction of mouse artery sections under different freezing conditions

圖2 三種冰凍條件下心臟結構改變的比較A.液氮浸入法的心肌形態結構( ×10)；B.液氮漂浮法的心肌形態結構( ×10)；C.直接-80 ℃法的心肌形態結構( ×10)；D.液氮浸入法的心肌形態結構( ×40)；E.液氮漂浮法的心肌形態結構( ×40)；F.直接-80 ℃法的心肌形態結構( ×40)Figure 2 Comparison of the structural changes of the heart under three freezing conditions圖3 三種冰凍條件下胸主動脈結構改變的比較A.液氮浸入法的胸主動脈形態結構( ×10)；B.液氮漂浮法的胸主動脈形態結構( ×10)；C.直接-80 ℃法的胸主動脈形態結構( ×10)；D.液氮浸入法的胸主動脈形態結構( ×40)；E.液氮漂浮法的胸主動脈形態結構( ×40)；F.直接-80 ℃法的胸主動脈形態結構( ×40)Figure 3 Comparison of the structural changes of thoracic aorta under three freezing conditions

3 討 論

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后在冷凍狀態下用切片機進行切片的方法[5]，其作為一種有效且快速的實驗方法廣泛應用于科學研究和臨床診斷中。在臨床上，冰凍切片技術已經成為了病理科的一項常規技術，無論術中快速診斷還是常規病理診斷[6-7]，其準確率更與切片質量密切相關。想要得到高質量的切片應對過程中涉及到的各個環節細致對待，不同組織本身的差異性也應區別看待，這要求實驗人員在工作中不斷積累經驗，摸索出最合適的條件和操作手法。

不同組織在不同冰凍速度下所表現的結果存在差異。研究證明，快速超低溫的冷凍極易使腦組織因冰凍不均勻而破裂，但若置于液氮中慢慢冷凍1～2 min，可以減少凍裂現象的發生[8]。有研究指出在液氮表面上方的蒸氣中的距離不同，導致冷凍速度差異，冰凍效果有差別[9]。本研究中，心肌和骨骼肌均是橫紋肌組織，但結果仍然不同，心肌的最優條件是液氮漂浮法而骨骼肌則為液氮浸入法。血管組織相對于心肌和骨骼肌較薄，液氮浸入法和液氮漂浮法均能快速將組織完全冰凍，對其結構上不會有明顯的改變。但直接-80 ℃保存幾乎對所有的組織都不適用，可能是跨過最大冰晶生成帶時間稍長，組織內形成更大的冰晶使其完整性遭到破壞[10-11]。因此，水分含量比較大的組織更應引起注意，在取下組織后盡量避免接觸液體試劑或在生理鹽水中浸泡，并且采用濾紙吸除水分等方法以防冰晶的大量形成，影響冰凍效果[12]。另外，根據滲透壓及微波的原理也可以有效消除組織內水分[13]。

本研究所用的慢速冷凍方法是直接-80 ℃法，此法的缺點是在包埋劑凍實前組織容易發生位置偏移。相比于慢速冷凍，速凍的方法可以快速跨過冰晶形成的溫度區間從而降低冰晶對組織結構的損傷，效果更好。目前應用于科學研究中的組織速凍方法很多，常見的有液氮速凍、液氮/異戊烷法速凍、干冰/無水乙醇混合物速凍等[14]。液氮/異戊烷法速凍是將包埋后的組織放入用液氮預冷的異戊烷中速凍。有研究曾嘗試將此方法改進，分為分步凍存法和一步凍存法[15]。前者是將肌肉組織先放入冰塊預冷的異戊烷中10 s，在放入液氮預冷的異戊烷中10 s，最后放入液氮中10 s，再進行包埋和-80 ℃冰箱保存。后者是將包埋好的組織放入液氮預冷的異戊烷中60 s，暫時存放到液氮中后再-80 ℃冰箱保存。結果是分步凍存法下冰晶形成更少，細胞結構更加完整。所以梯度降溫在組織凍存方法中合理利用是非常重要的。干冰/無水乙醇混合物速凍是將無水乙醇置于干冰中提前預冷，將干冰緩慢加入到無水乙醇至形成黏稠狀液體，再將包埋后的組織放入干冰/無水乙醇混合物中速凍。液氮速凍時若操作不當容易造成組織發脆，甚至直接斷裂的情況發生，液氮漂浮法則可以避免過度冷凍，改善了這種現象。相比較于其他方法，本文中涉及到的液氮浸入法和液氮漂浮法不需要多余的試劑，操作更為簡便。

綜上所述，不同的冰凍方法都有各自的優缺點，比如關于方法的簡化和冰凍時間的具體化等方面可能需要進一步改良。現已提供了一種摸索組織冰凍最優條件的思路和方法，為新手操作提供參考。