MiR-18B-5p調節BTG3及其下游信號通路促進肝細胞癌的發生發展

焦文鵬，侯 琳，崔妹娟，焦文靜，張金艷*

(1.河北醫科大學第四醫院放一科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學第四醫院內分泌科，河北 石家莊 050011；3.河北醫科大學第三醫院病案室，河北 石家莊 050051；4.河北醫科大學第四醫院檢驗科，河北 石家莊 050011)

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一[1-5]，其主要治療方式為手術切除和肝移植，但其預后較差，5年生存率只有20%～50%[6-7]。尋找肝癌相關的腫瘤標志物有助于改善患者預后。微小核醣核酸(MicroRNAs，miRNAs)是一種短鏈非編碼RNAs，其與肝癌的發生和發展密切相關，是肝癌腫瘤標志物的合適選擇[8-12]。研究顯示， miR-18B-5p在肝癌細胞中有不同程度的表達，可以成為新的肝癌腫瘤標志物[13]。本研究旨在探討miR-18B-5p和肝癌患者臨床病理因素的關系及其作用機制，報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2012年1月1日—2018年12月31日于河北醫科大學第四醫院進行手術治療的原發性肝癌患者329例，隨訪至2020年5月31日，資料完整者321例，隨訪率為97.6%。其中存活84例，死于肝癌237例。隨訪時間2～103個月，平均(31.16±25.24)個月。其中，男性213例，女性108例；年齡41～73歲，平均(56.26±7.99)歲。

本研究經過醫院倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2臨床隨訪研究 出院后每6個月進行一次標準化隨訪。所有患者從診斷到死亡或最后一次隨訪至少12個月。生存期從患者入院時間開始計算，到患者死亡或最后隨訪時間為止點。

1.3細胞系來源 實驗室HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B細胞系購自南京凱基生物制品有限公司。采用10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco，美國)的RPMI 1640培養基(Gibco，美國)中培養。

1.4下調HepG2細胞miR-18B-5p表達 將HepG2細胞(5×105個)鋪在6孔板上，在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養，直至細胞密度增至50%時加入附帶嘌呤霉素抗性的病毒液(吉凱基因)，病毒感染6 h換普通培養基培養，用嘌呤霉素濃度為0.6 μmol/L的全培養基篩選10 d，所得細胞為感染成功的細胞。通過qPCR檢驗其下調效果。

1.5細胞實驗CCK-8分析 將HepG2細胞接種于96孔板(5×105個/孔)中，在37 ℃和5%CO2中培養1～4 d，每孔加入20 μL CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。將酶標儀的波長設置為450 nm，檢測CCK-8混合物的光密度(optical density，OD)值，以分析活性。重復測量3次，取平均值。

1.6細胞實驗Transwell分析 將對數生長期的HepG2細胞用胰蛋白酶消化后，再懸浮于無血清DMEM培養基中，將細胞密度調整為5×104個/mL，將600 μL含10% FBS的DMEM培養基加入轉孔器下腔，將200 μL無血清細胞懸液用水合BD凝膠基膜加入上腔。培養24 h后，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞2次，用4%多聚甲醛固定15 min，室溫下風干。細胞用結晶紫染色10 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次。用棉簽輕輕擦拭上層的未遷移細胞，33%醋酸脫色，在570 nm處用酶標儀進行分析。重復測量3次，取平均值。

1.7細胞實驗定量實時RT-PCR 常規兩步法提取HepG2細胞和患者血清中總RNA。miR-18B-5p擴增引物序列如下：miR-18B-5p的引物(引物序列為正向5′-GCGTAAGGTGCATCTAGTGCAG-3′反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-GTATTCGCACTGGATACGACCTAACT-3′)。U6，上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游5′-CGAATTTGCGTGTCATCCTTG-3′。參考試劑盒說明書進行qPCR分析。PCR反應條件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s、60 ℃、30 s、72 ℃、30 s，共40個循環。miR-18B-5p mRNA的表達水平以2-△△Ct值表示。患者血清中miR-18B-5p表達水平根據相對表達水平的均值分為高miR-18B-5p表達組和低miR-18B-5p表達組。重復測量3次，取平均值。

1.8統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、F檢驗、LSD-t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher′s精確概率法，采用Kaplan-Meier法計算生存率，采用單因素和多因素Cox回歸模型確定影響觀察生存率的因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1高miR-18B-5p表達組和低miR-18B-5p表達組臨床病理特征比較 高miR-18B-5p表達組和低miR-18B-5p表達組在性別、年齡、肝硬化患者占比和肝炎患者占比方面差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 miR-18B-5p與患者臨床病理特征的關系Table 1 The relationship between miR-18B-5p and clinical pathological characteristics of patients (例數)

2.2高miR-18B-5p表達組和低miR-18B-5p表達組患者生存的比較 低miR-18B-5p表達組患者生存率高于高miR-18B-5p表達組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-18B-5p表達的肝癌患者的總生存期Figure 1 Overall survivals in hepatocellular carcinoma patients with miR-18B-5p expression

2.3兩組miR-18B-5p表達水平患者預后因素分析 單變量分析顯示，年齡、腫瘤大小、TNM分期和miR-18B-5p(P<0.001)影響患者生存率，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 肝癌患者生存的單因素分析Table 2 Univariate analysis of survival in patients with hepatocellular carcinoma

以年齡(<60歲=0，≥60歲=1)、腫瘤大小(<5 cm=0，≥5 cm=1)；TNM 分期(Ⅰ+Ⅱ期=0，Ⅲ期=1)；miR-18B-5p(低表達=0，高表達=1)為自變量，以患者生存時間為因變量，多因素分析結果顯示，miR-18B-5p的表達水平(RR:2.064，95%CI:1.522～2.800)和年齡(RR:1.762，95%CI:1.347～2.305)是患者生存的影響因素，見表3。

表3 肝癌患者生存的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of survival in patients with hepatocellular carcinoma

2.4下調miR-18B-5p抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲 HepG2細胞表達的miR-18B-5p水平高于Bel-7402組、MHCC97組和Hep3B組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。通過感染慢病毒的方法下調miR-18B-5p的表達，根據CCK-8實驗結果，Si-miR-18B-5p細胞系的Si-miR-18B-5p表達和細胞增殖低于HepG2細胞系，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5，圖2。用涂有或不涂基質凝膠的Transwell平板中的細胞檢測細胞的遷移和侵襲水平，在Si-miR-18B-5p細胞系miR-18B-5p下調，細胞遷移和侵襲能力低于HepG2細胞系，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表4 不同細胞系miR-18B-5p表達水平Table 4 The expression level of miR-18B-5p in different cell lines

表5 HepG2和Si-miR-18B-5p細胞中miR-18B-5p表達水平比較Table 5 Comparison of miR-18B-5p expression levels in HepG2 and Si-miR-18B-5p cells

圖2 HepG2和Si-miR-18B-5p細胞增殖水平比較(結晶紫染色× 400)A.HepG2細胞遷移；B.Si-miR-18B-5p細胞遷移；C.HepG2細胞侵襲；D.Si-miR-18B-5p細胞侵襲Figure 2 Comparison of proliferation levels in HepG2 and Si-miR-18B-5p cells(crystal violet staining× 400)

表6 HepG2和Si-miR-18B-5p細胞遷移能力和侵襲能力比較Table 6 Comparison of migration ability and invasion ability of HepG2 and Si-miR-18B-5p cells

2.5miR-18B-5p直接靶向BTG3調節BTG3表達 根據qRT-PCR，Si-miR-18B-5p細胞中BTG3的mRNA表達高于HepG2細胞系，差異有統計學意義(P<0.05)，見表7。BTG3可能在miR-18B-5p的失調中起重要作用，構建了含有BTG3的熒光素酶報告基因，具有野生型(WT)或突變型(Mut)BTG3結合位點研究miR-18B-5p的靶點，結果顯示，BTG3 WT相對熒光素活性低于BTG3 Mut，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3，表8。

表7 HepG2和Si-miR-18B-5p細胞BTG3 mRNA表達水平比較Table 7 Comparison of BTG3 mRNA expression levels in HepG2 and Si-miR-18B-5p cells

圖3 BTG3結合位點堿基序列Figure 3 Base sequence of BTG3 binding site

表8 不同組相對熒光素活性比較Table 8 Comparison of relative fluorescein activity of different groups

3 討 論

由于肝癌患者預后不佳，早期診斷和早期治療有助于改善患者預后。既往文獻顯示miR-18B-5p在肝癌細胞中表達水平不同，有可能作為新的肝癌腫瘤標志物應用于臨床，本研究旨在分析miR-18B-5p與肝癌的關系。

本研究結果顯示，miR-18B-5p表達水平較低的肝細胞癌患者生存率較高，單因素分析結果表明血清中miR-18B-5p的表達水平與病變的大小、TNM分期及生存期相關，多因素分析顯示miR-18B-5p高表達是肝癌患者預后不良的獨立影響因素。Zhang等[14]研究認為患者血清miR-18B-5p表達水平可作為結直腸癌患者診斷的生物學指標。Cochetti等[15]報道血清中miR-18B-5p的表達水平可用于診斷前列腺增和前列腺癌。本研究結果與上述研究結論相似，表明血清中miR-18B-5p的表達水平可以應用于肝癌患者的臨床診斷，并可以對患者的臨床病理因素和預后進行預測。

本研究進一步通過體外實驗探索miR-18B-5p在肝癌細胞中的作用機制，通過慢病毒感染的方法下調HepG2中miR-18B-5p的表達，抑制了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。與此研究結果不同，Xue等[16]報道miR-18B-5p可降低卵巢癌細胞的增殖和轉移，抑制癌細胞的生長發育。Xue等[17]研究表明miR-18b-5p可通過VMA21軸抑制肺腺癌的增殖。另有研究認為miR-18b-5p能增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制是抑制細胞分裂因子4的表達[18]。本研究結果證明miR-18B-5p在肝癌細胞中可以促進其增殖、遷移和侵襲。

本研究檢測BTG3在HepG2和Si-miR-18B-5p細胞中的表達，結果顯示，BTG3在Si-miR-18B-5p細胞中的表達水平是HepG2細胞的2.578倍。下調miR-18B-5p表達后，顯示后者能促進BTG3的表達。免疫熒光酶報告基因實驗結果顯示，MiR-18b-5p通過結合靶基因BTG3的mRNA上的3′-UTR抑制BTG3，從而促進肝癌的增殖和轉移。BTG3是抗增殖蛋白家族的B細胞轉運體基因/轉運體的成員[19]，是細胞周期和細胞增殖重要的負向調節劑[20-22]。BTG3與多種腫瘤的進展和轉移有關，可通過與E2F1結合而負調節細胞生長[21]。研究顯示，BTG3可以通過調節AKT /GSK3β/β-Catenin通路阻止腫瘤的進展[23]。因此，miR-18b-5p通過靶向BTG3促進肝細胞癌的增殖、侵襲和轉移可作為今后靶向治療的新思路。

綜上所述，miR-18b-5p的臨床意義在于其可用于肝癌的早期診斷和預測預后，尤其是基于血清miR-18b-5p的表達水平。血清miRNA檢測具有操作簡單、標本易取、價格低廉等優點，更適合臨床工作。