ZEB1對食管癌細胞侵襲轉移的影響及作用機制研究

李俊峰，徐 俊，李曉雷，李涵冰

(1.四川省南充市中心醫院胸心外科，川北醫學院第二臨床學院，四川 南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院甲狀腺乳腺外科，四川 南充 637000)

食管癌(esophageal cancer，EC)是一類發生于食管上皮組織的消化道腫瘤，在所有惡性腫瘤中，EC的發病率為2%，它包括食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma carcinoma，EADC)兩種類型，ESCC的發病率高于EADC[1]。由于具有高浸潤性和侵襲轉移強的特點，ESCC的治療效果差、引起患者不良預后[2]。因此，深入探究ESCC浸潤轉移機制有助于為該疾病的治療提供新策略。促進惡性腫瘤細胞發生侵襲轉移能力關鍵過程是上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發生[3]。在EMT發生過程中，E盒結合鋅指蛋白1(zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1)是關鍵的調控轉錄因子，在多種腫瘤中通過誘導EMT來促進腫瘤的浸潤及侵襲轉移。ZEB1屬于E盒結合鋅指蛋白家族，通過結合E-box啟動子元件促進下游基因轉錄[3]。ZEB1高表達也常見于在轉移性較高的上皮腫瘤細胞中[4]。此外，細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路及其下游蛋白c-Myc也在EMT的發生過程中起著調控作用，從而促進腫瘤侵襲轉移[3]。而在ESCC中，ZEB1的表達加快腫瘤進程并促進淋巴結轉移[5]，但ZEB1對ESCC侵襲轉移的調控機制還少有研究。本研究通過基因敲除手段，考察ZEB1表達對ESCC侵襲轉移能力的影響，并探討ZEB1對侵襲轉移和細胞增殖相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株 ESCC細胞系EC9706購買于ATCC(American Type Culture Collection)。

1.2試劑及耗材 細胞總RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)實驗中，總RNA利用RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒，反轉錄cDNA使用、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，RT-qPCR操作利用SYBR Green PCR Master Mix染料，RT-qPCR相關試劑均購買于南京諾唯贊生物科技有限公司。RT-qPCR引物購買于蘇州金唯智生物科技有限公司，ZEB1 primers序列為，F:5′-GCCAATAAGCAAACGATTCTG-3′；R:TTTGGCTGGATCACTTTCAAG。shRNA陰性對照質粒及ZEB1 shRNA慢病毒質粒購買于德國默克公司，ZEB1 shRNA序列：5′-CCGGTGT-CTCCCATAAGTATCAATTCTCGAGAATTGA-TACTTATGGGAGACATTTTTG-3′，CCK8檢測試劑盒購買于上海翊圣生物科技有限公司。WB抗體包括β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin和E-cadherin，購買于美國Cell Signaling Technology公司。細胞培養試劑包括DMEM無血清培養基、Gibco血清、胰酶，購買于美國GIBCO公司。免疫印跡法(Western blot，WB)所需試劑，RIPA Buffer和PierceTMBCA Protein Assay Kit購買于美國ThermoFisher公司；SDS-PAGE膠成分Tris 6.8，Tris 8.8，29：1聚丙烯酰胺溶液、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、TMED、過硫酸銨購買自上海生工生物工程股份有限公司；電泳所需電源、制膠架、電泳槽及轉膜槽購買自美國伯樂Bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 DMEM培養基(dulbecco′s minimum essential medium，DMEM)用超純水溶解后，按比例加入一定量的碳酸氫鈉，0.22 μm無菌濾膜過濾分裝。使用時加入Gibco胎牛血清，120 mg/L鏈霉素和120 U/mL青霉素，配成含10%血清的DMEM培養基。EC9706細胞置于37 ℃含5% CO2的細胞培養孵箱中孵育增殖。待細胞密度達到80%～90%后胰酶消化并傳代。

1.3.2RT-qPCR 細胞提取總RNA：轉染shRNA陰性對照組的EC9706細胞和ZEB1 shRNA沉默后的EC9706細胞從細胞培養瓶中消化，收集離心后，用PBS洗滌2次。細胞沉淀中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 0.5 mL，用槍頭反復吹打，直至細胞團塊完全消失；加入RNase Free dH2O 200 μL，上下顛倒混勻后，常溫靜置15 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；避免接觸管底沉淀，吸取400 μL上清轉移至新離心管，加入400 μL異丙醇，反復震蕩20 s，然后室溫靜置15 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；保留管底白色團塊，用移液器吸去上清，75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，常溫干燥。RNA定量：將乙醇揮發后的RNA用RNase Free dH2O溶解，利用分光光度計和Thermo ScientificTMNanoDropTMQC軟件對總RNA濃度進行檢測，并用RNase Free dH2O將每組RNA濃度調整為1 g/L。逆轉錄cDNA：按5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O配方一次加入，至總體積10 μL。42 ℃孵育2 min后，于4 ℃冷卻，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，5×PrimeScriptBuffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O和RT Primer Mix 1.0 μL至總體積20 μL，程序37 ℃運行15 min。85 ℃滅活15 s后終止反應。PCR反應體系如下配制：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，PCR Forward Primer 0.25 μL，PCR Reverse Primer 0.25 μL，cDNA溶液0.5 μL，RNase Free dH2O 4 μL。每個濃度至少測量3個復孔。ABI 7500型熒光定量PCR儀，設定PCR反應程序：Stage 1：預變性Reps：1，95 ℃ 30 s；Stage 2：PCR反應 Reps：50，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，進行實時定量PCR擴增。最后，對熒光實時定量PCR數據進行分析，獲得結果。

1.3.3慢病毒shRNA轉染 慢病毒ZEB1 shRNA轉染：利用HIV病毒將自身基因組插入整合到宿主基因組的特性，讓目的細胞穩定表達shRNA，實現沉默目的基因的作用。操作流程：在處于對數生長期的293T細胞內加入10 μg質粒和HIV病毒合成所需要的組分(10 μL Lentiviral Mix和60 μL HG TransgeneTM Reagent)；培養24 h后病毒被293T細胞分泌到胞外，此時回收培養基上清(含病毒)，用0.22 μm濾頭過濾后，加入到需要被轉染EC9706細胞培養基內；感染EC9706細胞48 h后，將培養基中加入嘌呤霉素進行真核細胞藥物篩選，存活下來的即穩轉成功的細胞。

1.3.4CCK8(Cell Counting Kit-8)實驗 轉染shRNA陰性對照組的ESCC細胞系EC9706和沉默了ZEB1表達的EC9706細胞消化后重懸，以100 μL/孔等量均勻地加入96孔板，兩組細胞平行6個副孔。待細胞貼壁后，培養到密度為70%～80%后加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃含5% CO2的細胞培養孵箱中培養1～4 h后，與450 nm波長下檢測吸光度(optical density，OD)。計算后可得相對細胞活力水平。

1.3.5劃痕實驗 轉染shRNA陰性對照組的ESCC細胞系EC9706及敲除ZEB1的EC9706細胞進行消化后，用1 mL培養體系均勻培養在6孔板中。待細胞貼壁生長并在密度達到80%后，用移液器槍頭在孔內細胞上劃痕，保證每條劃痕線寬度均勻且平行。劃線結束后，用滅菌后PBS輕輕洗滌6孔板，將劃痕后漂浮的細胞去除，留下清晰可見的劃痕線。對6孔板劃痕的固定位置進行記錄拍照。劃痕0 h拍照記錄細胞生長狀態后，將六孔板放置回37 ℃細胞培養孵箱繼續培養；24 h后再次記錄細胞生長狀態。

1.3.6Western blot 收集細胞：對數期生長的轉染shRNA陰性對照組的EC9706及敲除ZEB1的EC9706細胞進行消化后，將細胞培養皿用PBS清洗2次后，合并細胞懸液和洗液，轉移至塑料離心管，2 300 r/min轉速下離心3 min，用移液器棄去上清液，細胞團塊用1 mL PBS重懸后，轉移到于1.5 mL離心管里，2 000 r/min離心5 min，將上清吸凈。蛋白提取：盡可能用移液槍將PBS去除干凈。將提前配好的蛋白裂解液按與細胞等體積的量加入1.5 mL Tube管，與細胞混合并輕輕打勻，置于冰上，裂解55 min，每隔10 min輕輕彈動EP管底部。裂解完畢后，用離心機以12 000 r/min離心30 min，將蛋白上清小心吸出并加入新的離心管中。BCA法用于測定樣品蛋白含量，將蛋白用水調至同一濃度。然后在蛋白中加入1/3蛋白體積的loading buffer混勻。100 ℃水浴變性10 min后，放置于冰上冷卻10 min，12 500 r/min離心1 min后準備上樣。如果不立即使用，應將蛋白保存在-20 ℃冰箱中。制膠及電泳分離蛋白：制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V濃縮膠，140 V分離膠，運行1～1.5 h。全濕轉膜：電泳后取下膠，按尺寸剪取濾紙及NC膜，并將它們浸泡在全濕轉膜緩沖液中10 min。按海綿→濾紙→NC膜→膠→濾紙→海綿的順序依次疊放整齊，除了膜不能用試管搟壓外，每鋪一層都用試管去除氣泡。將夾板放入槽中，加入全濕緩沖液，恒流230 mA，轉膜時間為2 h；轉膜過程中，轉膜裝置放在冰盒中。麗染：將轉膜后的NC膜浸泡在麗春紅染液中，慢搖1 min后用dH2O震蕩、清洗，根據Marker指示，剪下目標條帶，標記，用PBS洗去麗春紅。封閉：配制3% BSA封閉液，將條帶封閉，37 ℃恒溫搖床中孵育1 h。抗體孵育：用PBST將封閉后的條帶蕩洗一遍，用PBST配制一抗，將條帶用一抗封袋，37 ℃恒溫搖床孵育1 后4 ℃孵育過夜；一抗孵育結束后，PBST洗3次，10 min清洗一次。用PBST配制二抗，封袋，37 ℃恒溫搖床反應1 h。曝光：二抗孵育結束后，用PBST清洗條帶，清洗3次，每次10 min。用PBS浸泡條帶后，配置ECL顯色液，將條帶漂洗10 s后采用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀進行曝光成像。

1.4統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用成組設計的t檢驗、配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ZEB1 shRNA敲除EC9706細胞中ZEB1表達 為了探究ZEB1蛋白表達是否對ESCC細胞系EC9706的增殖和侵襲轉移有關，本研究首先構建了ZEB1敲除的EC9706細胞系。采用ZEB1 shRNA對EC9706細胞系進行慢病毒侵染，通過培養和篩選后獲得ZEB1敲減后的穩轉細胞株。通過RT-qPCR實驗檢測ZEB1 shRNA轉染后EC9706細胞的ZEB1 mRNA轉錄水平。結果顯示，與陰性對照組相比，ZEB1 shRNA顯著降低了ZEB1 mRNA的表達水平(P<0.001)。見表1。

表1 ZEB1 shRNA抑制EC9706細胞ZEB1 mRNA表達Table 1 ZEB1 shRNA inhibited the expression of ZEB1 mRNA in EC9706 cells

2.2敲除ZEB1的EC9706細胞活力降低 為探究敲低ZEB1的EC9706細胞的增殖能力，利用CCK8實驗考查細胞活力水平。與轉染shRNA陰性對照組的細胞相比，敲低ZEB1的EC9706細胞的細胞活力明顯降低(P<0.001)，見表2。

表2 ZEB1 shRNA抑制EC9706細胞活力水平Table 2 The cell viability of EC9706 cells was reduced by ZEB1 shRNA

2.3敲除ZEB1抑制EC9706細胞的侵襲轉移能力 利用劃痕實驗考察ZEB1蛋白表達對ESCC細胞系EC9706細胞的侵襲轉移能力的影響。轉染shRNA陰性對照組細胞在劃痕24 h后增殖迅速，愈合能力強，劃痕寬度顯著降低。而敲低了ZEB1表達的EC9706細胞，雖然也有一定程度的增殖和愈合，但劃痕寬度明顯大于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 ZEB1 shRNA抑制EC9706細胞侵襲轉移表3 ZEB1 shRNA inhibited metastasis of EC9706 cells

2.4敲除ZEB1抑制ERK1/2激活并調節侵襲轉移相關蛋白表達水平 針對EMT相關蛋白的表達進行研究，考察了ZEB1敲除后ERK1/2蛋白的表達和E-cadherin、N-cadherin的表達水平。結果顯示(圖1)，對比轉染shRNA陰性對照組細胞，轉染了ZEB1 shRNA的細胞，ZEB1蛋白表達水平明顯降低；敲減ZEB1后，細胞ERK1/2的激活水平被抑制；與EMT相關蛋白N-cadherin表達水平降低，E-cadherin表達水平增高。

圖1 ZEB1 shRNA抑制ERK1/2激活并調節cadherin表達水平Figure 1 ZEB1 shRNA inhibited activation of ERK1/2 and regulated expression of cadherin protein levels

3 討 論

食管癌是發生于食管上皮的惡性腫瘤[6]。目前，手術切除和新輔助化療食管癌的主要治療方法。應用于早期食管癌的治療方案主要是手術切除，當腫瘤進展到中晚期，由于轉移擴散的發生，手術治療效果較差，需要配合化療[7]?；熀头暖熓侵委熓彻馨┑闹匾椒?。而新輔助治療，是一種聯合化療或放療手段在食管癌術前的應用，其作用除了手術前降低食管癌腫瘤分期，使手術獲得更好療效以外，也應用于術后治療，避免腫瘤向遠處轉移，從而減少局部復發[8]。但由于食管癌的高侵襲轉移性，腫瘤轉移和局部復發依舊是食管癌治療的難點[9]。

惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的關鍵是上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，消除EMT從而抵抗腫瘤侵襲轉移是腫瘤治療的思路之一[10]。在人類惡性腫瘤中，有80%來源于上皮組織。通過EMT，原發性上皮組織腫瘤細胞可以形成間充質細胞，從而具備了遷移能力，進而向血管內侵襲，隨著血液循環轉移到人體內其他部位[11]。上皮腫瘤細胞最終通過EMT形成腫瘤轉移灶，該過程極大地促進了腫瘤進展和惡性程度，增加了臨床治療難度[11]。目前研究表明，調控EMT的主要轉錄因子包括Twist、Snail和ZEB[12]。ZEB家族是E盒結合鋅指蛋白(Zinc finger E-box binding homeobox)，包含ZEB1和ZEB2兩種類型[3]。在調控EMT發生中，ZEB1是關鍵的轉錄因子[3]。研究發現在多種腫瘤中，ZEB1可通過誘導EMT來促進上皮腫瘤細胞的侵襲轉移[13-14]。ZEB1啟動EMT的作用機制可能是ZEB1通過其鋅指結構與E-cadherin的啟動子區域結合、抑制E-cadherin表達來實現的。綜上所述，ZEB1在上皮腫瘤EMT發生和侵襲轉移過程中發揮著重要功能[13]。而其他和ZEB1相關的蛋白，如ERK、MAPK信號通路及其下游蛋白c-Myc，在EMT的發生中發揮著重要作用[15]。如在肺癌細胞中，EMT受到ERK和ZEB1通路的廣泛調節[16]。而本文針對侵襲轉移能力較強的ESCC細胞進行了研究，考察了ZEB1對癌細胞侵襲轉移的影響及ERK的表達變化，發現敲低ZEB1表達后，能夠顯著抑制ESCC細胞系ES9706細胞的細胞活力、降低細胞的侵襲轉移能力，并在蛋白水平抑制ERK1/2活性，促進E-cadherin表達和抑制N-cadherin表達。本研究結果顯示ZEB1在ESCC細胞侵襲轉移上發揮的關鍵作用，故而提示可以靶向ZEB1進行ESCC的治療。目前直接靶向ZEB1的小分子抑制劑還鮮有研究，但最新的研究進展中，發現組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑在針對肺癌的治療上可以逆轉EMT，使間充質細胞恢復為上皮細胞，這是通過HDAC抑制劑處理抗性細胞過程中可以抑制ZEB1功能而實現的[17]。除了直接抑制ZEB1活性外，ZEB1也受到上游因子PI3K、STAT3和SIRT等蛋白調控[14,18]。如PI3K抑制劑BENC-511，可以通過調控β-catenin-ZEB1通路來抑制非小細胞肺癌細胞侵襲轉移[18]。所以也可以通過抑制ZEB1蛋白上游調控因子、干擾ZEB1信號環路，或是切斷ZEB1下游控制元件來抑制ZEB1相關通路，從而起到抑制腫瘤細胞EMT和侵襲轉移的作用。由于ESCC細胞具有的強侵襲轉移性和難治性，故而靶向ZEB1從而達到抗ESCC具有一定研究價值和臨床意義。而本研究將在后續的研究中，將致力探討ERK1/2是否介導ZEB1對E-cadherin和N-cadherin的調控作用，通過過表達ERK1/2觀察ZEB1敲除下EMT的變化，從而深入研究ZEB1在ESCC侵襲轉移進展中發揮的關鍵作用，并尋找干擾ZEB1活性的小分子化合物及其抗腫瘤機制。